A što je sa “studijom” koju je objavila CORVELVA?

Bili smo zamoljeni komentirati „studije“ koju je objavila talijanska Corvelva. Te se “studije” dosta dijele po internet prostoru i zbunjuju ljude. Krenut ćemo s prvom.

Ukratko, postoji tvrdnja kako cjepiva uopće ne sadrže što je napisano (što je teška optužba) te kako sadrže strane, neobične tvari od kojih neke mogu biti štetne. Krenimo najprije sa zaključkom, a detalje možete pročitati kasnije u tekstu. Teško je napraviti komentar koji nije stručan i dugačak, pa sami procijenite koliko možete razumjeti.

1. Autori nisu svoje metode usporedili sa službenim metodama Europske farmakopeje koje su i nastale jer su najtočnije. Ovo je početnička i/ili namjerna greška razine studentske pogreške, a ne pogreške iskusnog analitičara.
2. Napravljen je niz metodoloških grešaka u analizi proteinskog sadržaja, s bombastičnom tvrdnjom kako osnovnog sadržaja cjepiva, a to su antigeni koji stvaraju imunološke reakcije – nema. No, jasno je da nisu uopće ispitali i riješili efekt matriksa, odnosno drugih tvari u cjepivu koji smetaju u toj analizi. Ovo je doista početnička greška. Autori su vjerojatno mjerili šum.
3. „Nepoznate i opasne“ tvari nisu uopće analitički određene, nego su autori signal na spektrometriji masa potražili u informatičkoj bazi a ti sami signali su dvosmisleni (vidi objašnjenje). Za puno određivanje moraju napraviti i validirati te tehnike na cjepivu kako bi se anulirao efekt matriksa, uz korištenje analitičkih standarda koji su dostupni.
4. Ovo je pretenciozni „analitički izvještaj“ koji će, na žalost, samo zapaliti one koji o ovom području nemaju pojma ali imaju emocija. To je već puno puta viđen scenarij. Nemojte biti dio tog scenarija.

Analitika cjepiva i ispitivanja kakvoće doista nisu jednostavni. Postoje striktne procedure s razlogom, jer su cjepiva smjesa različitih molekula i metode analize moraju biti prikladne takvoj smjesi, kako ne bi nastali lažni rezultati. Takve tehnike usavršavale su se desetljećima. U znanstvenim publikacijama koje se bave analitičkom (bio)kemijom postoji jasno pravilo objavljivanja detalja metodologije i uvjeta analize, kako bi druge grupe neovisno mogle reproducirati (ponoviti) rezultate. To je uobičajena praksa koju zahtijevaju u ozbiljnim znanstvenim časopisima.

Proučimo sada elementarne pogreške počinila Corvelva studija, dio po dio.
 
Results and Discussion 1. Analysis of the composition declared in the vaccine leaflet U tablici autori su naveli što cjepiva deklarirano sadrži, a što su autori našli.

Glavni je problem metodologija. Autori se pozivaju na SANIST tehnologiju. SANIST je softverska platforma za analizu analitičkih rezultata putem SACI/ECI-MS metode analize (Surface‐Activated Chemical Ionization/Electrospray Ionization mass spectrometry). Autori se pozivaju na referencu Adriana et al. iz 2015 godine u Rapid Communications in Mass Spectrometry. No sami autori originalne studije iz 2015. godine kažu kako je ta metoda dobra za molekule manje molekularne mase (Interest is rapidly rising in the Surface‐Activated Chemical Ionization/Electrospray Ionization (SACI‐ESI) technology due to its application for highly sensitive detection of low molecular weight compounds, in particular when applied for biomarker discovery.) Ovdje autori govore i o proteinima gdje je priprema uzorka sasvim drugačija od molekula manje molekulske mase. Druga citirana referenca (Cristoni et al., 2017. J. Mass. Spec.) ne udaljava se od predložene metodologije analize malih organskih molekula.

U tablici se navodi koje točno molekule su nađene, a koje nisu nađene tom metodom. Nisu našli formaldehid, primjerice, kao ni polimiksin. Jesu li si time dali autogol, ako on nije u cjepivu Infanrix hexa, a toliko plaše ljude s njim? Autogol je dvostruki. Prvo, proizvođačima cjepiva je i želja što bolje ukloniti formaldehid, pa su time talijanski autori samo potvrdili te težnje. Drugi autogol je neznanje. Trebali su paralelno napraviti metodu Europske farmakopeje koje se pridržavaju svi proizvođači cjepiva. Potom su te dvije metode trebali usporediti. Ovo je jedna od početničkih grešaka studentske razine znanosti. Činjenica je da je njihova metoda nedovoljno osjetljiva za detekciju (pronalazak) formaldehida u cjepivu, a nisu analizirali niti jednom drugom metodom, među kojima je već citirana farmakopejska metoda. Ovo vrijedi za sve komponentne u cjepivu koje su analizirali, uključujući i rezidualne tragove antibiotika.

Sami „linkovi“ kod pojedinog analita su pogrešni. Ako objavljuju rezultate, očekujemo da daju reference na način analize koji je publiciran. Ovako su linkovi tek rezultati pretraživanja Googlea s Pubchem ili WHO referencama. Autori navode kako nisu detektirali SACI/ECI-MS SANIST metodom toksoide. Ovdje treba samo ući u metodu. Autori prvo kažu kako su „tražili“ signal (M+nH)n+. Čak i ako ne razumijete, ovo je pogrešno, jer bi to značilo da su autori samo tražili jednu molekulu, cijelog proteina. Analiza cijelog proteina takozvanim MS tehnikama nije jednostavna, toksoidi nisu jednostavne strukture jer su kemijski modificirani toksini – time ih se čini neopasnima i to se radi pomoću formaldehida. Tek kasnije autori sugeriraju kako su radili uobičajenom metodom, nakon cijepanja toksoida enzimom tripsinom. No, tada ovaj signal (M+nH)n+ nije točan u tablici! Ponovno, nisu se potrudili koristiti službenu farmakopejsku metodu, flokulacijski test, koji je i uveden kao najtočniji.

2.1 – 1st analysis: Digestion as it is Inkubiran je uzorak s enzimom tripsinom i autori kažu „kako nisu našli protein“ nakon inkubacije. Na stranu što je ideja određivanja proteina NAKON digestije neobična, autori NE NAVODE METODU detekcije proteina – SACI/ECI-MS kojeg jedinog citiraju to nije. O ovdje se nisu potrudili barem koristiti rutinske farmakopejske metode.
2.2 – 2nd Analysis: Digestion of Precipitate Ovdje su autori centrifugirali uzorak, mliječna suspenzija koju autori navode potječe od aluminijevog fosfata u Infanrix hexa, s vezanim proteinima. Autori su nastali talog podvrgnuli enzimu koji cijepa proteine, a potom išli određivati proteine. I opet, nisu naveli metodu, kao ni u prethodnom slučaju.
2.3 – 3rd analysis: Bradford assay U ovom dijelu su autori čisti uzorak (očito bez razgradnje proteina) analizirali Bradford metodom, rutinskom tehnikom u kojoj se koristi boja, Coomassie Brilliant Blue G-250, za određivanje proteina. Sada su, logično, našli proteine. Nije jasno da li su tu metodu koristili u prethodna dva dijela eksperimenta? Vrlo su nedorečeni. Usput, Bradford metoda nije ni približno jedina, pogotovo ne u kontekstu Farmakopeje, pa su autori propustili koristiti druge metode i usporediti ih. U kontekstu ovog, nije nam jasan razlog 2.1 i 2.2 analiza.

2.4 – 4th analysis: Digestion as it is at 57 ° C Ovdje opisuju metodu digestije proteina tripsinom, a potom su (valjda, jer ne navode izrijekom) koristili SACI/ECI-MS metodu. U njoj su određivali fragmente proteina. Ovdje postoji velika greška. Autori su koristili čisti uzorak, nisu čak niti naveli korištenje pufera! Ne znamo da li su autori barem to poduzeli kako bi enzim imao optimalne uvjete koje pufer omogućuje. Ovdje su napravili studentsku pogrešku i nisu PAZILI NA EFEKT MATRIKSA odnosno svih drugih sastojaka u cjepivu. 

Stranica Skepticalraptor koja je objavila svoju kritiku ove „studije“ navodi mogućnost aluminijevih iona iz cjepiva koji može zaustaviti djelovanje tripsina. Slažem se djelomično s njima s tim ali pojavljuje se drugi problem – ako NE maknemo adsorbens (aluminij fosfat/hidroksid) neće biti samo problem inhibicije (zaustavljanja) enzima, već i adsorpcije odnosno vezanja svih proteina koji samim vezanjem mogu spriječiti djelovanje tripsina. Autori su prema njihovim riječima CENTRIFUGIRALI uzorak nakon digestije, ne vodeći računa o tome da adjuvant može „povući“ sve proteine sa sobom. Tehnički gledano, uklonili su vlastiti – uzorak! Nanosili su supernatant s tragovima proteina. Nisu dokazali efikasnu deapsorpciju proteina („micanje“ proteina s adjuvansa). Nisu dokazali problem takvog matriksa u analizi. To je velika pogreška. Skepticalraptor navodi i mogući utjecaj polisorbata u cjepivu i to je moguće, zajedno s ostatkom matriksa.

Autori su „nešto“ našli u tom supernatantu, premda nisu dali nikakve podatke iz originalnog dokumenta ili analitičkog uređaja. Potom su objavili te „sekvence“ pocijepanih proteina, koji navodno sliče na uzorke proteina vrlo egzotičnih gljiva. Primjerice, prva gljiva je Calocera cornea koja raste na trulom drvetu i njeno prisustvo u cjepivu ravno je znanstvenoj fantastici. Još je fantastičnije potencijalno prisustvo jedne vrste – kruške.

Tablica 2. 

Ovo je tablica „kontaminanata“. Kontaminante su identificirali SAMO PREKO MOLEKULARNE MASE, pa jedna molekularna masa može biti više mogućih tvari. Na primjer, iz jednog signala našli su da to može biti:

2. Salicin 6-phosphate 

3. Pachyrrhizone 

4. Arnottin II 

5. Tetracenomycin F1.

Drugim riječima, nisu niti naveli koja je količina tih tvari u tragovima, niti su potvrdili njihovu strukturu niti prisustvo. Da bi tvrdili da su doista unutra moraju uzeti analitičke standarde tih tvari i dokazati ih. To nisu napravili. Time ljude ne-educirane u kemiji i analitici dovde u zabludu. Odjednom ispada da ima 43 „kontaminanta“, a u stvarnosti su detektirali 24 molekule, a da uopće nisu sigurni koje su to molekule, jer nisu usporedili s analitičkim standardima. 

Za tako ozbiljne tvrdnje NIJE dovoljno samo olako uspoređivati s bazama podataka i ne napraviti ništa drugo. Osim toga, nisu naveli kvantitet, odnosno koliko ih ima. Da je doista, recimo prisutan Atovaquone, antimalarik (a vjerojatno nije, sve dok autori doista to ne dokažu), i ako ga ima pikogram – koja je biološka relevantnost toga?

 

Tablica 3 

Tablica 3 je ista pogreška kao i tablica 2, samo su autori izdvojili toksične molekule. Greška metodologije i interpretacije je ista kao i u tablici 2.

5/5
Podijelite dalje

dr.sc. Stribor Marković mag.pharm.

1992. godine upisujem studije medicinske biokemije na Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu. Nakon završene četiri godine studija odlučujem upisati i studij farmacije. Svoj tadašnji znanstveni interes imao sam prilike razviti radeći kroz dvije godine diplomski rad kod dr. Blaženke Grahovac i cijelom tadašnjem timu Hrvatskog zavoda za transfuzijsku medicinu u čijem sam laboratoriju imao prilike napraviti svoje prve korake. Diplomirao sam na temu molekularnog određivanja vrste Borrelia burgdorferi sensu lato u kliničkim uzorcima. Zahvalan sam i drugoj mentorici, profesorici Marici Medić-Šarić na gotovo majčinskoj podršci i na prvoj znanstvenoj publikaciji. 1998. godine diplomirao sam oba studija i stekao titule magistra farmacije i diplomiranog inženjera medicinske biokemije. Vrlo kratko sam 1998. godine radio kao asistent na zavodu za organsku kemiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta, a već iste godine zapošljavam se u istraživačkom institutu PLIVA d.d. čiji sam stipendist bio dvije godine. Počeo sam raditi kao istraživač u grupi koja se bavila istraživanjem novih protuupalnih lijekova kod dr. Mladena Merćepa. Njemu sam zahvalan, kao i svim kolegama, na svemu što sam naučio u znanosti, a toga je bilo puno. Biram li između istraživanja u industriji i akademskom okružju odabirem industrijsko okružje. Plod toga je nekoliko znanstvenih publikacija i više patenata. Postajem direktor istraživačkog programa u PLIVA d.d., a potom i voditelj stanične biologije u GlaxoSmithKline (GSK). Teško je nabrojati sve što sam prošao u znanstvenom iskustvu, od in vivo modela, molekularne i stanične biologije i niza tehnika. Smatram to privilegijom jer današnji koncept znanosti u industriji katkad više ograniči ljude nego im daje slobode. Više se ne smatram istraživačem i znanstvenikom, premda je, tko zna, jednom moguće da se vratim na taj posao. Ne volim ni da me tako zovu jer se ne volim krivo predstavljati. Kao prilog svoje povijesti prilažem listu radova. Ipak, ta povijest posla mi je dala puno vrijednog i zahvalan sam nekima omraženoj farmaceutskoj industriji na svemu što znam. 2005. godine postao sam doktor farmaceutskih znanosti s temom disertacije „Konjugati makrolida i glukokortikoida kao nova klasa protuupalnih lijekova.“ 2011. godine igrom neobičnog slučaja zaposlit ću se u Imunološkom zavodu d.d. najprije na Zavodu za transfuzijsku medicinu, a potom i kao direktor kvalitete. Bez obzira na težinu, to mi je bila velika privilegija i naučiti suptilnosti kontrole kvalitete cjepiva i proizvoda ljudske plazme obogati čovjeka za nivo striktnosti u kvaliteti koju druge grane industrije jedva dosežu. Bila mi je teška odluka otići i dan danas mi je žao te institucije i predivnih kolega koje sam tamo upoznao. Gdje su tu eterična ulja i biljke? Bezazleni tečaj aromamasaže u Aromari 2001. godine na kraju se pretvorio u hobi i interes. Zahvalan sam svojoj tadašnjoj tvrtki da je to bez problema ne samo tolerirala već su me i neki kolege ohrabrivali. Stekao sam samo jednu impresiju: svijet ljekovitih biljaka i eteričnih ulja je kaotični divlji Zapad u odnosu na striktnost svijeta farmaceutske industrije. U njemu ima potencijala koji treba razviti. Vremenom, to mi je postao moj glavni posao. Trebao sam položiti test i vlastite naivnosti i vremenom sam izgradio sve jasniji stav što je u tom svijetu prirodnih tvari i lijekova smisleno, a što je odnijela povijest. Svijet New Age-a ostavio je gorke uspomene na svijet „alternative“ i o tome trebam jednom napisati knjigu. Moj interes prema biljkama proširio se davno u svijet kozmetike, ali osobno ružno iskustvo dr. Stribor kozmetike udaljilo me još prije 3 godine od tog svijeta. Što sam znao, prenio sam na Plantageu kao mali hommage tom vremenu. Ako ikada nadrastem to gorko iskustvo ovaj interes, barem u smislu hobija, možda će se vratiti. Da bi se to desilo, ono staro prvo mora umrijeti, ali o tome više ne odlučujem ja. Moj današnji svijet je uvijek podređen osobnom učenju i iskustvu. Savjetujem pacijente i drago mi je što sam uopće prvi u struci razvio takav koncept koji je dio posla XXI. Stoljeća. Zahvaljujem se Atlantic Farmacia na uspješnoj suradnji kroz godine. Educiram puno druge i iz povijesti svojih prethodnih poslova pokušavam prenijeti svoja iskustva drugima i poraditi na općem znanju ne samo medicinskih djelatnika već cijelog društva. Aktivno pišem na Facebooku, izdao sam knjigu koja je plod tog pisanja, u grupi Samoniklog jestivog bilja, ali i u grupi Cijepljenje/vakcinacija – grupa za sve koji imaju pitanja i nedoumice, čime se zahvaljujem Imunološkom zavodu. Znam biti težak, premda sam uglavnom blagog karaktera. Tvrdoglav sam, ponekad prednost, katkad mana. Tko me povrijedio/la i financijski iskoristio/la, zauvijek ima zatvorena vrata. Nisam zlopamtilo osim u ekstremima kojih, srećom, nema puno. Na prste dvije ruke. Volim planinariti, to već mnogi znaju. Volim biljke ali i sve prirodne znanosti. Govorim francuski i engleski jezik. Više na: https://www.plantagea.hr/o-meni/