A što je sa “studijom” koju je objavila CORVELVA?

25. veljače 2019.7. travnja 2019. dr. sc. Stribor Marković, mag. pharm. Cijepljenje, cjepiva, CORVELVA, studija corvelva

Bili smo zamoljeni komentirati „studije“ koju je objavila talijanska Corvelva. Te se “studije” dosta dijele po internet prostoru i zbunjuju ljude. Krenut ćemo s prvom.

Ukratko, postoji tvrdnja kako cjepiva uopće ne sadrže što je napisano (što je teška optužba) te kako sadrže strane, neobične tvari od kojih neke mogu biti štetne. Krenimo najprije sa zaključkom, a detalje možete pročitati kasnije u tekstu. Teško je napraviti komentar koji nije stručan i dugačak, pa sami procijenite koliko možete razumjeti.

1. Autori nisu svoje metode usporedili sa službenim metodama Europske farmakopeje koje su i nastale jer su najtočnije. Ovo je početnička i/ili namjerna greška razine studentske pogreške, a ne pogreške iskusnog analitičara.

2. Napravljen je niz metodoloških grešaka u analizi proteinskog sadržaja, s bombastičnom tvrdnjom kako osnovnog sadržaja cjepiva, a to su antigeni koji stvaraju imunološke reakcije – nema. No, jasno je da nisu uopće ispitali i riješili efekt matriksa, odnosno drugih tvari u cjepivu koji smetaju u toj analizi. Ovo je doista početnička greška. Autori su vjerojatno mjerili šum.

3. „Nepoznate i opasne“ tvari nisu uopće analitički određene, nego su autori signal na spektrometriji masa potražili u informatičkoj bazi a ti sami signali su dvosmisleni (vidi objašnjenje). Za puno određivanje moraju napraviti i validirati te tehnike na cjepivu kako bi se anulirao efekt matriksa, uz korištenje analitičkih standarda koji su dostupni.

4. Ovo je pretenciozni „analitički izvještaj“ koji će, na žalost, samo zapaliti one koji o ovom području nemaju pojma ali imaju emocija. To je već puno puta viđen scenarij. Nemojte biti dio tog scenarija.

Analitika cjepiva i ispitivanja kakvoće doista nisu jednostavni. Postoje striktne procedure s razlogom, jer su cjepiva smjesa različitih molekula i metode analize moraju biti prikladne takvoj smjesi, kako ne bi nastali lažni rezultati. Takve tehnike usavršavale su se desetljećima. U znanstvenim publikacijama koje se bave analitičkom (bio)kemijom postoji jasno pravilo objavljivanja detalja metodologije i uvjeta analize, kako bi druge grupe neovisno mogle reproducirati (ponoviti) rezultate. To je uobičajena praksa koju zahtijevaju u ozbiljnim znanstvenim časopisima.

Proučimo sada elementarne pogreške počinila Corvelva studija, dio po dio.

Results and Discussion 1. Analysis of the composition declared in the vaccine leaflet U tablici autori su naveli što cjepiva deklarirano sadrži, a što su autori našli.

Glavni je problem metodologija. Autori se pozivaju na SANIST tehnologiju. SANIST je softverska platforma za analizu analitičkih rezultata putem SACI/ECI-MS metode analize (Surface‐Activated Chemical Ionization/Electrospray Ionization mass spectrometry). Autori se pozivaju na referencu Adriana et al. iz 2015 godine u Rapid Communications in Mass Spectrometry. No sami autori originalne studije iz 2015. godine kažu kako je ta metoda dobra za molekule manje molekularne mase (Interest is rapidly rising in the Surface‐Activated Chemical Ionization/Electrospray Ionization (SACI‐ESI) technology due to its application for highly sensitive detection of low molecular weight compounds, in particular when applied for biomarker discovery.) Ovdje autori govore i o proteinima gdje je priprema uzorka sasvim drugačija od molekula manje molekulske mase. Druga citirana referenca (Cristoni et al., 2017. J. Mass. Spec.) ne udaljava se od predložene metodologije analize malih organskih molekula.

U tablici se navodi koje točno molekule su nađene, a koje nisu nađene tom metodom. Nisu našli formaldehid, primjerice, kao ni polimiksin. Jesu li si time dali autogol, ako on nije u cjepivu Infanrix hexa, a toliko plaše ljude s njim? Autogol je dvostruki. Prvo, proizvođačima cjepiva je i želja što bolje ukloniti formaldehid, pa su time talijanski autori samo potvrdili te težnje. Drugi autogol je neznanje. Trebali su paralelno napraviti metodu Europske farmakopeje koje se pridržavaju svi proizvođači cjepiva. Potom su te dvije metode trebali usporediti. Ovo je jedna od početničkih grešaka studentske razine znanosti. Činjenica je da je njihova metoda nedovoljno osjetljiva za detekciju (pronalazak) formaldehida u cjepivu, a nisu analizirali niti jednom drugom metodom, među kojima je već citirana farmakopejska metoda. Ovo vrijedi za sve komponentne u cjepivu koje su analizirali, uključujući i rezidualne tragove antibiotika.

Sami „linkovi“ kod pojedinog analita su pogrešni. Ako objavljuju rezultate, očekujemo da daju reference na način analize koji je publiciran. Ovako su linkovi tek rezultati pretraživanja Googlea s Pubchem ili WHO referencama. Autori navode kako nisu detektirali SACI/ECI-MS SANIST metodom toksoide. Ovdje treba samo ući u metodu. Autori prvo kažu kako su „tražili“ signal (M+nH)n+. Čak i ako ne razumijete, ovo je pogrešno, jer bi to značilo da su autori samo tražili jednu molekulu, cijelog proteina. Analiza cijelog proteina takozvanim MS tehnikama nije jednostavna, toksoidi nisu jednostavne strukture jer su kemijski modificirani toksini – time ih se čini neopasnima i to se radi pomoću formaldehida. Tek kasnije autori sugeriraju kako su radili uobičajenom metodom, nakon cijepanja toksoida enzimom tripsinom. No, tada ovaj signal (M+nH)n+ nije točan u tablici! Ponovno, nisu se potrudili koristiti službenu farmakopejsku metodu, flokulacijski test, koji je i uveden kao najtočniji.

2.1 – 1st analysis: Digestion as it is Inkubiran je uzorak s enzimom tripsinom i autori kažu „kako nisu našli protein“ nakon inkubacije. Na stranu što je ideja određivanja proteina NAKON digestije neobična, autori NE NAVODE METODU detekcije proteina – SACI/ECI-MS kojeg jedinog citiraju to nije. O ovdje se nisu potrudili barem koristiti rutinske farmakopejske metode.

2.2 – 2nd Analysis: Digestion of Precipitate Ovdje su autori centrifugirali uzorak, mliječna suspenzija koju autori navode potječe od aluminijevog fosfata u Infanrix hexa, s vezanim proteinima. Autori su nastali talog podvrgnuli enzimu koji cijepa proteine, a potom išli određivati proteine. I opet, nisu naveli metodu, kao ni u prethodnom slučaju.

2.3 – 3rd analysis: Bradford assay U ovom dijelu su autori čisti uzorak (očito bez razgradnje proteina) analizirali Bradford metodom, rutinskom tehnikom u kojoj se koristi boja, Coomassie Brilliant Blue G-250, za određivanje proteina. Sada su, logično, našli proteine. Nije jasno da li su tu metodu koristili u prethodna dva dijela eksperimenta? Vrlo su nedorečeni. Usput, Bradford metoda nije ni približno jedina, pogotovo ne u kontekstu Farmakopeje, pa su autori propustili koristiti druge metode i usporediti ih. U kontekstu ovog, nije nam jasan razlog 2.1 i 2.2 analiza.

2.4 – 4th analysis: Digestion as it is at 57 ° C Ovdje opisuju metodu digestije proteina tripsinom, a potom su (valjda, jer ne navode izrijekom) koristili SACI/ECI-MS metodu. U njoj su određivali fragmente proteina. Ovdje postoji velika greška. Autori su koristili čisti uzorak, nisu čak niti naveli korištenje pufera! Ne znamo da li su autori barem to poduzeli kako bi enzim imao optimalne uvjete koje pufer omogućuje. Ovdje su napravili studentsku pogrešku i nisu PAZILI NA EFEKT MATRIKSA odnosno svih drugih sastojaka u cjepivu.

Stranica Skepticalraptor koja je objavila svoju kritiku ove „studije“ navodi mogućnost aluminijevih iona iz cjepiva koji može zaustaviti djelovanje tripsina. Slažem se djelomično s njima s tim ali pojavljuje se drugi problem – ako NE maknemo adsorbens (aluminij fosfat/hidroksid) neće biti samo problem inhibicije (zaustavljanja) enzima, već i adsorpcije odnosno vezanja svih proteina koji samim vezanjem mogu spriječiti djelovanje tripsina. Autori su prema njihovim riječima CENTRIFUGIRALI uzorak nakon digestije, ne vodeći računa o tome da adjuvant može „povući“ sve proteine sa sobom. Tehnički gledano, uklonili su vlastiti – uzorak! Nanosili su supernatant s tragovima proteina. Nisu dokazali efikasnu deapsorpciju proteina („micanje“ proteina s adjuvansa). Nisu dokazali problem takvog matriksa u analizi. To je velika pogreška. Skepticalraptor navodi i mogući utjecaj polisorbata u cjepivu i to je moguće, zajedno s ostatkom matriksa.

Autori su „nešto“ našli u tom supernatantu, premda nisu dali nikakve podatke iz originalnog dokumenta ili analitičkog uređaja. Potom su objavili te „sekvence“ pocijepanih proteina, koji navodno sliče na uzorke proteina vrlo egzotičnih gljiva. Primjerice, prva gljiva je Calocera cornea koja raste na trulom drvetu i njeno prisustvo u cjepivu ravno je znanstvenoj fantastici. Još je fantastičnije potencijalno prisustvo jedne vrste – kruške.

Tablica 2.

Ovo je tablica „kontaminanata“. Kontaminante su identificirali SAMO PREKO MOLEKULARNE MASE, pa jedna molekularna masa može biti više mogućih tvari. Na primjer, iz jednog signala našli su da to može biti:

2. Salicin 6-phosphate

3. Pachyrrhizone

4. Arnottin II

5. Tetracenomycin F1.

Drugim riječima, nisu niti naveli koja je količina tih tvari u tragovima, niti su potvrdili njihovu strukturu niti prisustvo. Da bi tvrdili da su doista unutra moraju uzeti analitičke standarde tih tvari i dokazati ih. To nisu napravili. Time ljude ne-educirane u kemiji i analitici dovde u zabludu. Odjednom ispada da ima 43 „kontaminanta“, a u stvarnosti su detektirali 24 molekule, a da uopće nisu sigurni koje su to molekule, jer nisu usporedili s analitičkim standardima.

Za tako ozbiljne tvrdnje NIJE dovoljno samo olako uspoređivati s bazama podataka i ne napraviti ništa drugo. Osim toga, nisu naveli kvantitet, odnosno koliko ih ima. Da je doista, recimo prisutan Atovaquone, antimalarik (a vjerojatno nije, sve dok autori doista to ne dokažu), i ako ga ima pikogram – koja je biološka relevantnost toga?

Tablica 3

Tablica 3 je ista pogreška kao i tablica 2, samo su autori izdvojili toksične molekule. Greška metodologije i interpretacije je ista kao i u tablici 2.

 5/5

Broj pregleda: 1.530

Podijelite dalje