Analiza strukture RNA cjepiva (za one koji žele znati više)

Analiza strukture RNA cjepiva (za one koji žele znati više)

 
Opaska: članak je zahtjevnije gradivo, ali se nadam da će vam biti zanimljiv.
 
Na samom kraju 2020. godine Pfizer i Svjetska zdravstvena organizacija objavili su točnu strukturu mRNA koja se nalazi u cjepivu. Osobno mi se sviđa takva transparentnost.
 
Često je ponavljan narativ kako ne znamo što se nalazi u cjepivima i lijekovima. Zahvalio bih se srpskoj znanstvenici Isidori Stanković što je odmah po objavljivanju sekvence objavila tu vijest na svojoj stranici i lijepo objasnila funkciju pojedinih dijelova mRNA cjepiva. Podsjetite se prethodnih članaka o otkriću i funkciji RNA ovdje i ovdje. Podsjetite se i zanimljivog članka dr. Igora Bereckog u kojem je lijepo objasnio i osnovno gradivo o RNA i DNA, uključujući i izraze poput kodona koje ćemo susresti i u ovom članku.
 
Kodon se sastoji od tri nukleotida koji određuju ribosomu gdje se je start (početak) proteina, koje će aminokiseline i kojim slijedom graditi određeni protein te određuje završetak proteina. Na primjer, AUG je start kodon, CCU kodon kodira aminokiselinu prolin, a CUU aminokiselinu leucin.
 
U prethodnim smo člancima samo površno dotaknuli pojam „prebacivanja gena“ za šiljak (spike) protein virusa SARS-CoV-2. Lak posao? Samo naizgled. To može napraviti studentica/student molekularne biologije u studentskom laboratoriju. Izolirat će RNA virusa i pretvoriti je u DNA pomoću enzima reverzne transkriptaze. Potom se pomoću PCR tehnike točno odabere gen za protein šiljka, od start kodona do stop kodona.
 
PCR tehnika je rutinska tehnika molekularne biologije koja se koristi u dijagnostici i znanstvenom istraživanju. Primjerice, u dijagnostici se koristi za potvrđivanje infekcije ako se zarazite virusom hepatitisa B. U sljedećem koraku biotehnološkom proizvodnjom se proizvede puno (m)RNA. Podsjetite se kako se proizvode mRNA cjepiva.
 
 
Priča je ipak malo kompliciranija.
Virusi su genetski vrlo udaljeni od čovjeka i neki virusi u dijelu svojih gena sadrže kodone koje ljudska stanica rijetko koristi. Još jednom ponavljam da ponovite pojam kodona u članku dr. Bereckog.
 
Korištenje kodona koji se rijetko koriste može smanjiti stvaranje proteina, stoga je prvi korak bila optimizacija kodona koji se rijetko koriste. U odnosu na izvorni gen napravljen je niz mutacija koje ne mijenjaju proteinski sastav, već samo mijenjaju kodone koji se rijetko koriste u kodone koji se često koriste. To je bio prvi korak. Tim promjenama se povećava uspješnost stvaranja željenog proteina.
 
 
Drugi korak je borba s nestabilnošću proteina šiljka virusa SARS-CoV-2. Drugim riječima, kada se i stvori, taj protein bi bio prekratko „živio“ u našim stanicama i ne bi stvarao dobar imunološki odgovor. Kako? Srećom, virus SARS-CoV-2 nije prvi iz svoje obitelji pa su znanstvenici shvatili da ga mogu stabilizirati jednostavnim zamjenama aminokiselina na proteinima šiljka i kod virusa SARS-CoV-1 i MERS. Kada se aminokiseline lizin na poziciji 986 i valin na poziciji 987 proteina šiljka (spike proteina) zamijene aminokiselinom prolinom, takav je protein stabilniji. Ta promjena ne smanjuje efikasnost imunizacije protiv proteina „divljeg“ (prirodnog) virusa SARS-CoV-2. Tko želi znati više, pročitajte referencu 1.
 
mRNA ne može funkcionirati bez dijelova koji nisu samo kodoni koji kodiraju protein šiljka. Prvi važan dio je „kapica“. Kapica se sastoji od baza – adenozina i gvanozina, a koje se moraju metilirati (na njih se doda CH3 skupina). Stoga je kapica prvi dio koji se dodaje u mRNA molekulu. Kapica daje stabilnost mRNA i omogućuje stvaranje proteina na ribosomima. Na koji način se na RNA molekulu nadograđuju strukture poput kapice? Mogu se nadograditi kemijskim ili enzimskim putem. Za vas koji ste znatiželjni, detalje procesa nadograđivanja možete pronaći u referenci 2.
 
Nakon kapice nalazi se tzv. 5′ netranslatirana regija. To je dio mRNA koji se ne prepisuje u protein, ali je bitan za njegovu funkciju. Znanstvenici su uzeli 5′ netranslatiranu regiju iz ljudske mRNA za protein alfa-globin, a koji se nalazi u sastavu hemoglobina, proteina koji transportira kisik u crvenim krvnim stanicama. U tom području, kod samo start kodona, nalazi se Kozakova sekvenca i nju su također znanstvenici morali uvesti u mRNK.
 
Kozakova sekvenca omogućuje prepoznavanje pravog start signala (kodona) AUG. Naime, start kodon AUG se ponavlja u svakoj mRNK više puta. To bi moglo „zbuniti“ ribosom odakle da počne stvaranje proteina. Kozakova sekvenca omogućuje da ribosom prepoznaje pravi start kodon.
 
Tek nakon kapice i 5′-netranslatirane regije slijedi dio koji kodira protein šiljka.
Različite mRNA molekule znatno se razlikuju u stabilnosti. Jedan od faktora koji utječe na stabilnost mRNA je tzv. 3′-netranslatirana regija koja se nalazi nakon kodirajućeg dijela mRNA. U slučaju mRNA cjepiva protiv virusa SARS-CoV-2 znanstvenici su stvorili 3′-netranslatiranu regiju od AES sekvence (od engleske skraćenice za amino-terminal enhancer of split) te dijela RNA za 12S mitohondrijsku ribosomsku RNA.
 
Takva modifikacija omogućuje dovoljno dug život u stanici da stvori protein šiljka, a prije no se prirodnim procesima razgradi. Nakon tih sekvenci nalazi se poli-A rep koji se sastoji od 70 adenozina i koji je prisutan u svim mRNA molekulama.
 
RNA, kao što ste mogli pročitati u članku dr. Bereckog, a ponovite i na videu Jelene, sastoji se od četiri baze – AUGC. Najveća kemijska modifikacija na molekuli mRNK je zamjena uridina s 1-metil-3′-pseudouridinom. 1-metil-3′-pseudouridin je derivat pseudouridina, baze koje prirodno nastaje u raznim RNA molekulama u tijelu. 1-metil-3′-pseudouridin povećava efikasnost nastanka proteina iz mRNA i istovremeno smanjuje mogući pretjerani imunološki odgovor koje bi stvorila prevelika količina „klasične“ mRNA. Otkriće 1-metil-3′-pseudouridina bilo je vrlo bitno u povijesti razvoja mRNA cjepiva i lijekova. Više informacija možete naći u referencama 3 i 4.
 
Može li se dogoditi da stanica „krivo prepiše“ ovakvu mRNA odnosno napravi protein pogrešne strukture? Moguće je, no takve pogreške nastaju svaki dan, svake sekunde i s našim mRNA molekulama. Što se događa s tim proteinima? Oni se razgrađuju kao i svi drugi proteini. O tome više pročitajte u referenci 5.
 
mRNA tehnologija je spretna jer je – brza. Atenuiranje virusa i bakterija je dugotrajni proces (podsjetite se ovdje i ovdje  i razvoj takvih cjepiva traje vrlo dugo. Čak i rekombinantna tehnologija bude sporija. Pročitajte više i u referenci 6.
Sekvenca mRNA u cjepivu protiv virusa SARS-CoV-2 dostupna je ovdje.
 
Reference:
1. bioRxiv. 2020 Sep 17:2020.09.
2. Beilstein J Org Chem. 2017; 13: 2819–2832.
3. Journal of Controlled Release 217 (2015) 337–344
4. Nucleic Acids Res. 2017 Jun 2;45(10):6023-6036.
5. Nat Rev Genet. 2009 Oct; 10(10): 715–724.
6. Nat Rev Drug Discov. 2018 Apr;17(4):261-279.
5/5
Podijelite dalje

dr.sc. Stribor Marković mag.pharm.

1992. godine upisujem studije medicinske biokemije na Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu. Nakon završene četiri godine studija odlučujem upisati i studij farmacije. Svoj tadašnji znanstveni interes imao sam prilike razviti radeći kroz dvije godine diplomski rad kod dr. Blaženke Grahovac i cijelom tadašnjem timu Hrvatskog zavoda za transfuzijsku medicinu u čijem sam laboratoriju imao prilike napraviti svoje prve korake. Diplomirao sam na temu molekularnog određivanja vrste Borrelia burgdorferi sensu lato u kliničkim uzorcima. Zahvalan sam i drugoj mentorici, profesorici Marici Medić-Šarić na gotovo majčinskoj podršci i na prvoj znanstvenoj publikaciji. 1998. godine diplomirao sam oba studija i stekao titule magistra farmacije i diplomiranog inženjera medicinske biokemije. Vrlo kratko sam 1998. godine radio kao asistent na zavodu za organsku kemiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta, a već iste godine zapošljavam se u istraživačkom institutu PLIVA d.d. čiji sam stipendist bio dvije godine. Počeo sam raditi kao istraživač u grupi koja se bavila istraživanjem novih protuupalnih lijekova kod dr. Mladena Merćepa. Njemu sam zahvalan, kao i svim kolegama, na svemu što sam naučio u znanosti, a toga je bilo puno. Biram li između istraživanja u industriji i akademskom okružju odabirem industrijsko okružje. Plod toga je nekoliko znanstvenih publikacija i više patenata. Postajem direktor istraživačkog programa u PLIVA d.d., a potom i voditelj stanične biologije u GlaxoSmithKline (GSK). Teško je nabrojati sve što sam prošao u znanstvenom iskustvu, od in vivo modela, molekularne i stanične biologije i niza tehnika. Smatram to privilegijom jer današnji koncept znanosti u industriji katkad više ograniči ljude nego im daje slobode. Više se ne smatram istraživačem i znanstvenikom, premda je, tko zna, jednom moguće da se vratim na taj posao. Ne volim ni da me tako zovu jer se ne volim krivo predstavljati. Kao prilog svoje povijesti prilažem listu radova. Ipak, ta povijest posla mi je dala puno vrijednog i zahvalan sam nekima omraženoj farmaceutskoj industriji na svemu što znam. 2005. godine postao sam doktor farmaceutskih znanosti s temom disertacije „Konjugati makrolida i glukokortikoida kao nova klasa protuupalnih lijekova.“ 2011. godine igrom neobičnog slučaja zaposlit ću se u Imunološkom zavodu d.d. najprije na Zavodu za transfuzijsku medicinu, a potom i kao direktor kvalitete. Bez obzira na težinu, to mi je bila velika privilegija i naučiti suptilnosti kontrole kvalitete cjepiva i proizvoda ljudske plazme obogati čovjeka za nivo striktnosti u kvaliteti koju druge grane industrije jedva dosežu. Bila mi je teška odluka otići i dan danas mi je žao te institucije i predivnih kolega koje sam tamo upoznao. Gdje su tu eterična ulja i biljke? Bezazleni tečaj aromamasaže u Aromari 2001. godine na kraju se pretvorio u hobi i interes. Zahvalan sam svojoj tadašnjoj tvrtki da je to bez problema ne samo tolerirala već su me i neki kolege ohrabrivali. Stekao sam samo jednu impresiju: svijet ljekovitih biljaka i eteričnih ulja je kaotični divlji Zapad u odnosu na striktnost svijeta farmaceutske industrije. U njemu ima potencijala koji treba razviti. Vremenom, to mi je postao moj glavni posao. Trebao sam položiti test i vlastite naivnosti i vremenom sam izgradio sve jasniji stav što je u tom svijetu prirodnih tvari i lijekova smisleno, a što je odnijela povijest. Svijet New Age-a ostavio je gorke uspomene na svijet „alternative“ i o tome trebam jednom napisati knjigu. Moj interes prema biljkama proširio se davno u svijet kozmetike, ali osobno ružno iskustvo dr. Stribor kozmetike udaljilo me još prije 3 godine od tog svijeta. Što sam znao, prenio sam na Plantageu kao mali hommage tom vremenu. Ako ikada nadrastem to gorko iskustvo ovaj interes, barem u smislu hobija, možda će se vratiti. Da bi se to desilo, ono staro prvo mora umrijeti, ali o tome više ne odlučujem ja. Moj današnji svijet je uvijek podređen osobnom učenju i iskustvu. Savjetujem pacijente i drago mi je što sam uopće prvi u struci razvio takav koncept koji je dio posla XXI. Stoljeća. Zahvaljujem se Atlantic Farmacia na uspješnoj suradnji kroz godine. Educiram puno druge i iz povijesti svojih prethodnih poslova pokušavam prenijeti svoja iskustva drugima i poraditi na općem znanju ne samo medicinskih djelatnika već cijelog društva. Aktivno pišem na Facebooku, izdao sam knjigu koja je plod tog pisanja, u grupi Samoniklog jestivog bilja, ali i u grupi Cijepljenje/vakcinacija – grupa za sve koji imaju pitanja i nedoumice, čime se zahvaljujem Imunološkom zavodu. Znam biti težak, premda sam uglavnom blagog karaktera. Tvrdoglav sam, ponekad prednost, katkad mana. Tko me povrijedio/la i financijski iskoristio/la, zauvijek ima zatvorena vrata. Nisam zlopamtilo osim u ekstremima kojih, srećom, nema puno. Na prste dvije ruke. Volim planinariti, to već mnogi znaju. Volim biljke ali i sve prirodne znanosti. Govorim francuski i engleski jezik. Više na: https://www.plantagea.hr/o-meni/