Je li izoliran virus SARS-CoV-2?

Je li izoliran virus SARS-CoV-2?

 
Zadnjih godinu dana često nailazimo na tvrdnju kako virus SARS-COV-2 nije uopće dokazan niti izoliran. Ta se vijest stalno ponavlja pa je tako nedavno ponovo aktualizirana u Kanadi.
 
Da, virus SARS-CoV-2 je izoliran i dokazan je nizom tehnika poput tehnika analize gena, imunološkim tehnikama i elektronskom mikroskopijom. Za više detalja pročitajte ostatak članka.
 
Prva metoda otkrivanja novih virusa je kultivacija. Virusi ne mogu rasti na neživim podlogama kao što to može dio bakterija i gljivica, već uvijek zahtijevaju žive stanice u kojima se repliciraju (umnožavaju). Treba prvo naći stanice koje virus može zaraziti i u njima se umnožiti. Da bi virus mogao zaraziti stanicu, ta stanica mora imati receptor kojim virus ulazi u nju.
 
Prvi koronavirus koji napada ljude izolirali su D.A. Tyrrell i M.L. Bynoe. Oni su prvo pokušali kultivirati virus u do tada poznatim stanicama poput HeLa stanica, no nisu uspjeli. Stoga su se odlučili probati ih kultivirati u ljudskom tkivu. U bolnici s kojom su surađivali dobili su ljudske embrije kada su žene iz medicinskog razloga morale proći postupak uklanjanja maternice u ranoj trudnoći.
 
Traheje (dušnike) tih embrija održavali su neko vrijeme u kulturi s hranjivim medijem, slično kako se uzgajaju stanične linije. Traheje su odabrane jer su one mogle sadržavati stanice koje su osjetljive na takve viruse. Pacijentima s prehladom nos je ispran fiziološkom otopinom i nakon filtracije taj ispirak je dodan na dušnike u kulturi. U ispirku su prethodno analizirali prisustvo drugih tada poznatih virusa poput gripe.
 
Vrlo brzo u kulturi su uspješno umnoženi virusi. Te su viruse potvrdili imunološkim metodama te njihovom sposobnosti da izazovu bolest (prehladu) u zdravih dobrovoljaca. Kasnije su ih dokazali elektronskom mikroskopijom, a njihov izgled kao da imaju „krunu“ donio im je i naziv – koronavirusi.
 
Time su otkrili prvi od ukupno četiri koronavirusa koji uzrokuju prehladu. Ti su virusi danas poznati pod nazivima 229E, OC43, NL63 i HKU1. Ispitivanje sposobnosti da zaraze dobrovoljce smije se raditi samo s virusima kod kojih ne postoji veći rizik nastanka opasnog oblika bolesti i ne smije se raditi s virusima koji mogu izazvati klinički teške oblike bolesti. Koronavirusi koji izazivaju teže oblike bolesti, poput MERS ili SARS-CoV-2, ne smiju se ispitivati na ovaj način (referenca 1).
 
Druga tehnika je izolacija i analiza genetskog materijala virusa. Svaka vrsta virusa ima svoj specifičan genetski kod koji ih razlikuje od drugih virusa. Nobelovom nagradom za medicinu 2020. godine nagrađeni su znanstvenici koji su doista mukotrpnim radom, s tada dostupnim tehnikama, pronašli novi virus NonA-NonB (NANB) hepatitisa. Postojanje virusa NANB hepatitisa bilo je poznato duže vrijeme, no zbog nemogućnosti uspješne kultivacije, znanstvenici su morali koristiti drugačiji pristup.
 
Iz uzoraka krvi pacijenata oboljelih od tog hepatitisa stvorili su tzv. DNA knjižnicu. Trebalo bi nam cijelo poglavlje knjige da objasnimo pojam DNA knjižnice. Objasnit ću samo ukratko. RNA virusa se prepiše u DNA pomoću enzima reverzne transkriptaze, a potom se ubaci u prikladni „nosač“. Zatim taj materijal prenosimo u mikroorganizme poput bakterija. Jedna bakterija tako nosi jednu molekulu DNK, zato se zovu knjižnice jer svaka bakterija sliči na knjigu jedne velike knjižnice.
 
Najteži dio posla je među milijunima bakterija naći baš onu koji nosi gen koji nas zanima. Tim znanstvenika predvođenih D. W. Bradleyem i M. Houghtonom niz je godina tražio taj gen sve dok ga nije našao i svijetu su to objavili 1989. godine. Virus su dokazali genetskim i imunološkim metodama i od tada ga poznajemo kao virus hepatitisa C (HCV) (referenca 2).
 
Virus SARS-CoV-2 je izoliran kombinacijom tih tehnika. Virus je izoliran iz ispirka pluća (na engleskom jeziku bronchoalveolar lavage) pacijenata oboljelih od bolesti covid-19. Kao što su radili D.A. Tyrrell i M.L. Bynoe, tako su i kineski znanstvenici najprije dokazali odsustvo drugih potencijalnih uzročnika, ukupno 18 drugih potencijalnih virusa i 4 bakterije. Ispirak pluća su potom zasadili na ljudske stanice pluća čovjeka.
 
Iz ispirka pluća izolirali su RNA i prepisali je u DNA pomoću enzima reverzne transkriptaze, slično kao što su radili istraživači koji otkrili virus hepatitisa C. No, za razliku od mukotrpnog puta DNA knjižnica, danas raspolažemo drugačijim tehnikama koje istraživačima omogućuju da u roku nekoliko dana ili tjedana otkriju nove gene, za što su prije trebale godine. Te se tehnike zovu next generation sequencing i njihov je cilj otkriti nepoznate slijedove (sekvence) DNA.
 
Ubrzo su pronađene sekvence koje su slične drugim sekvencama koronavirusima i objavljen je cijeli genom novog virusa. Kineski istraživači su dokazali identični virus iz istog ispirka i u kulturi ljudskih stanica pluća te potvrdili virus i elektronskom mikroskopijom. Referenca 3 vam je dostupna u cijelosti i u njoj možete naći slike i dodatne podatke. Istraživači drugih zemalja napravili su slična istraživanja, kao primjere možete vidjeti podatke o Južnoj Koreji (referenca 4), Francuskoj (referenca 5) i Kanadi (referenca 6). U Hrvatskoj je izoliran u Zagrebu. Analize sekvenci DNA je vrlo specifična i omogućuje razlikovanje od drugih DNA molekula iz čovjeka ili staničnih linija. Ta analiza omogućuje i istraživanje mutacija koje nastaju u samom virusu.
 
Istraživači su uspješno uzgojili virus SARS-CoV-2 u nizu staničnih linija. Vero stanična linija, o kojoj smo pisali, pokazala se kao najbolja linija za rast ovog virusa. Više o tome kako se virus SARS-CoV-2 uzgaja i dokazuje možete pročitati u referenci 7 koja vam je u cijelosti dostupna. Kineska tvrtka Sinovac kreirala je cjepivo od inaktiviranog virusa SARS-CoV-2 uzgojenog na Vero staničnoj liniji.
 
Slika: SARS-CoV-2, elektronska mikroskopija. Strelice pokazuju virusne čestice u ljudskim stanicama, preuzeto iz reference 3.
 
1. Br Med J. 1965 Jun 5;1(5448):1467-70.
2. Science. 1989 Apr 21;244(4902):359-62.
3. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382(8):727-733.
4. J Korean Med Sci. 2020 Feb 24; 35(7): e84.
5. Lancet Infect Dis. 2020 Jun;20(6):697-706.
6. Emerg Infect Dis. 2020 Sep;26(9):2054-2063.
7. Virology. 2020 Sep; 548: 39–48.
5/5
Podijelite dalje

dr.sc. Stribor Marković mag.pharm.

1992. godine upisujem studije medicinske biokemije na Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu. Nakon završene četiri godine studija odlučujem upisati i studij farmacije. Svoj tadašnji znanstveni interes imao sam prilike razviti radeći kroz dvije godine diplomski rad kod dr. Blaženke Grahovac i cijelom tadašnjem timu Hrvatskog zavoda za transfuzijsku medicinu u čijem sam laboratoriju imao prilike napraviti svoje prve korake. Diplomirao sam na temu molekularnog određivanja vrste Borrelia burgdorferi sensu lato u kliničkim uzorcima. Zahvalan sam i drugoj mentorici, profesorici Marici Medić-Šarić na gotovo majčinskoj podršci i na prvoj znanstvenoj publikaciji. 1998. godine diplomirao sam oba studija i stekao titule magistra farmacije i diplomiranog inženjera medicinske biokemije. Vrlo kratko sam 1998. godine radio kao asistent na zavodu za organsku kemiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta, a već iste godine zapošljavam se u istraživačkom institutu PLIVA d.d. čiji sam stipendist bio dvije godine. Počeo sam raditi kao istraživač u grupi koja se bavila istraživanjem novih protuupalnih lijekova kod dr. Mladena Merćepa. Njemu sam zahvalan, kao i svim kolegama, na svemu što sam naučio u znanosti, a toga je bilo puno. Biram li između istraživanja u industriji i akademskom okružju odabirem industrijsko okružje. Plod toga je nekoliko znanstvenih publikacija i više patenata. Postajem direktor istraživačkog programa u PLIVA d.d., a potom i voditelj stanične biologije u GlaxoSmithKline (GSK). Teško je nabrojati sve što sam prošao u znanstvenom iskustvu, od in vivo modela, molekularne i stanične biologije i niza tehnika. Smatram to privilegijom jer današnji koncept znanosti u industriji katkad više ograniči ljude nego im daje slobode. Više se ne smatram istraživačem i znanstvenikom, premda je, tko zna, jednom moguće da se vratim na taj posao. Ne volim ni da me tako zovu jer se ne volim krivo predstavljati. Kao prilog svoje povijesti prilažem listu radova. Ipak, ta povijest posla mi je dala puno vrijednog i zahvalan sam nekima omraženoj farmaceutskoj industriji na svemu što znam. 2005. godine postao sam doktor farmaceutskih znanosti s temom disertacije „Konjugati makrolida i glukokortikoida kao nova klasa protuupalnih lijekova.“ 2011. godine igrom neobičnog slučaja zaposlit ću se u Imunološkom zavodu d.d. najprije na Zavodu za transfuzijsku medicinu, a potom i kao direktor kvalitete. Bez obzira na težinu, to mi je bila velika privilegija i naučiti suptilnosti kontrole kvalitete cjepiva i proizvoda ljudske plazme obogati čovjeka za nivo striktnosti u kvaliteti koju druge grane industrije jedva dosežu. Bila mi je teška odluka otići i dan danas mi je žao te institucije i predivnih kolega koje sam tamo upoznao. Gdje su tu eterična ulja i biljke? Bezazleni tečaj aromamasaže u Aromari 2001. godine na kraju se pretvorio u hobi i interes. Zahvalan sam svojoj tadašnjoj tvrtki da je to bez problema ne samo tolerirala već su me i neki kolege ohrabrivali. Stekao sam samo jednu impresiju: svijet ljekovitih biljaka i eteričnih ulja je kaotični divlji Zapad u odnosu na striktnost svijeta farmaceutske industrije. U njemu ima potencijala koji treba razviti. Vremenom, to mi je postao moj glavni posao. Trebao sam položiti test i vlastite naivnosti i vremenom sam izgradio sve jasniji stav što je u tom svijetu prirodnih tvari i lijekova smisleno, a što je odnijela povijest. Svijet New Age-a ostavio je gorke uspomene na svijet „alternative“ i o tome trebam jednom napisati knjigu. Moj interes prema biljkama proširio se davno u svijet kozmetike, ali osobno ružno iskustvo dr. Stribor kozmetike udaljilo me još prije 3 godine od tog svijeta. Što sam znao, prenio sam na Plantageu kao mali hommage tom vremenu. Ako ikada nadrastem to gorko iskustvo ovaj interes, barem u smislu hobija, možda će se vratiti. Da bi se to desilo, ono staro prvo mora umrijeti, ali o tome više ne odlučujem ja. Moj današnji svijet je uvijek podređen osobnom učenju i iskustvu. Savjetujem pacijente i drago mi je što sam uopće prvi u struci razvio takav koncept koji je dio posla XXI. Stoljeća. Zahvaljujem se Atlantic Farmacia na uspješnoj suradnji kroz godine. Educiram puno druge i iz povijesti svojih prethodnih poslova pokušavam prenijeti svoja iskustva drugima i poraditi na općem znanju ne samo medicinskih djelatnika već cijelog društva. Aktivno pišem na Facebooku, izdao sam knjigu koja je plod tog pisanja, u grupi Samoniklog jestivog bilja, ali i u grupi Cijepljenje/vakcinacija – grupa za sve koji imaju pitanja i nedoumice, čime se zahvaljujem Imunološkom zavodu. Znam biti težak, premda sam uglavnom blagog karaktera. Tvrdoglav sam, ponekad prednost, katkad mana. Tko me povrijedio/la i financijski iskoristio/la, zauvijek ima zatvorena vrata. Nisam zlopamtilo osim u ekstremima kojih, srećom, nema puno. Na prste dvije ruke. Volim planinariti, to već mnogi znaju. Volim biljke ali i sve prirodne znanosti. Govorim francuski i engleski jezik. Više na: https://www.plantagea.hr/o-meni/

Odgovori