Je li izoliran virus SARS-CoV-2?
Je li izoliran virus SARS-CoV-2?
Zadnjih godinu dana često nailazimo na tvrdnju kako virus SARS-COV-2 nije uopće dokazan niti izoliran. Ta se vijest stalno ponavlja pa je tako nedavno ponovo aktualizirana u Kanadi.
Da, virus SARS-CoV-2 je izoliran i dokazan je nizom tehnika poput tehnika analize gena, imunološkim tehnikama i elektronskom mikroskopijom. Za više detalja pročitajte ostatak članka.
Prva metoda otkrivanja novih virusa je kultivacija. Virusi ne mogu rasti na neživim podlogama kao što to može dio bakterija i gljivica, već uvijek zahtijevaju žive stanice u kojima se repliciraju (umnožavaju). Treba prvo naći stanice koje virus može zaraziti i u njima se umnožiti. Da bi virus mogao zaraziti stanicu, ta stanica mora imati receptor kojim virus ulazi u nju.
Prvi koronavirus koji napada ljude izolirali su D.A. Tyrrell i M.L. Bynoe. Oni su prvo pokušali kultivirati virus u do tada poznatim stanicama poput HeLa stanica, no nisu uspjeli. Stoga su se odlučili probati ih kultivirati u ljudskom tkivu. U bolnici s kojom su surađivali dobili su ljudske embrije kada su žene iz medicinskog razloga morale proći postupak uklanjanja maternice u ranoj trudnoći.
Traheje (dušnike) tih embrija održavali su neko vrijeme u kulturi s hranjivim medijem, slično kako se uzgajaju stanične linije. Traheje su odabrane jer su one mogle sadržavati stanice koje su osjetljive na takve viruse. Pacijentima s prehladom nos je ispran fiziološkom otopinom i nakon filtracije taj ispirak je dodan na dušnike u kulturi. U ispirku su prethodno analizirali prisustvo drugih tada poznatih virusa poput gripe.
Vrlo brzo u kulturi su uspješno umnoženi virusi. Te su viruse potvrdili imunološkim metodama te njihovom sposobnosti da izazovu bolest (prehladu) u zdravih dobrovoljaca. Kasnije su ih dokazali elektronskom mikroskopijom, a njihov izgled kao da imaju „krunu“ donio im je i naziv – koronavirusi.
Time su otkrili prvi od ukupno četiri koronavirusa koji uzrokuju prehladu. Ti su virusi danas poznati pod nazivima 229E, OC43, NL63 i HKU1. Ispitivanje sposobnosti da zaraze dobrovoljce smije se raditi samo s virusima kod kojih ne postoji veći rizik nastanka opasnog oblika bolesti i ne smije se raditi s virusima koji mogu izazvati klinički teške oblike bolesti. Koronavirusi koji izazivaju teže oblike bolesti, poput MERS ili SARS-CoV-2, ne smiju se ispitivati na ovaj način (referenca 1).
Druga tehnika je izolacija i analiza genetskog materijala virusa. Svaka vrsta virusa ima svoj specifičan genetski kod koji ih razlikuje od drugih virusa. Nobelovom nagradom za medicinu 2020. godine nagrađeni su znanstvenici koji su doista mukotrpnim radom, s tada dostupnim tehnikama, pronašli novi virus NonA-NonB (NANB) hepatitisa. Postojanje virusa NANB hepatitisa bilo je poznato duže vrijeme, no zbog nemogućnosti uspješne kultivacije, znanstvenici su morali koristiti drugačiji pristup.
Iz uzoraka krvi pacijenata oboljelih od tog hepatitisa stvorili su tzv. DNA knjižnicu. Trebalo bi nam cijelo poglavlje knjige da objasnimo pojam DNA knjižnice. Objasnit ću samo ukratko. RNA virusa se prepiše u DNA pomoću enzima reverzne transkriptaze, a potom se ubaci u prikladni „nosač“. Zatim taj materijal prenosimo u mikroorganizme poput bakterija. Jedna bakterija tako nosi jednu molekulu DNK, zato se zovu knjižnice jer svaka bakterija sliči na knjigu jedne velike knjižnice.
Najteži dio posla je među milijunima bakterija naći baš onu koji nosi gen koji nas zanima. Tim znanstvenika predvođenih D. W. Bradleyem i M. Houghtonom niz je godina tražio taj gen sve dok ga nije našao i svijetu su to objavili 1989. godine. Virus su dokazali genetskim i imunološkim metodama i od tada ga poznajemo kao virus hepatitisa C (HCV) (referenca 2).
Virus SARS-CoV-2 je izoliran kombinacijom tih tehnika. Virus je izoliran iz ispirka pluća (na engleskom jeziku bronchoalveolar lavage) pacijenata oboljelih od bolesti covid-19. Kao što su radili D.A. Tyrrell i M.L. Bynoe, tako su i kineski znanstvenici najprije dokazali odsustvo drugih potencijalnih uzročnika, ukupno 18 drugih potencijalnih virusa i 4 bakterije. Ispirak pluća su potom zasadili na ljudske stanice pluća čovjeka.
Iz ispirka pluća izolirali su RNA i prepisali je u DNA pomoću enzima reverzne transkriptaze, slično kao što su radili istraživači koji otkrili virus hepatitisa C. No, za razliku od mukotrpnog puta DNA knjižnica, danas raspolažemo drugačijim tehnikama koje istraživačima omogućuju da u roku nekoliko dana ili tjedana otkriju nove gene, za što su prije trebale godine. Te se tehnike zovu next generation sequencing i njihov je cilj otkriti nepoznate slijedove (sekvence) DNA.
Ubrzo su pronađene sekvence koje su slične drugim sekvencama koronavirusima i objavljen je cijeli genom novog virusa. Kineski istraživači su dokazali identični virus iz istog ispirka i u kulturi ljudskih stanica pluća te potvrdili virus i elektronskom mikroskopijom. Referenca 3 vam je dostupna u cijelosti i u njoj možete naći slike i dodatne podatke. Istraživači drugih zemalja napravili su slična istraživanja, kao primjere možete vidjeti podatke o Južnoj Koreji (referenca 4), Francuskoj (referenca 5) i Kanadi (referenca 6). U Hrvatskoj je izoliran u Zagrebu. Analize sekvenci DNA je vrlo specifična i omogućuje razlikovanje od drugih DNA molekula iz čovjeka ili staničnih linija. Ta analiza omogućuje i istraživanje mutacija koje nastaju u samom virusu.
Istraživači su uspješno uzgojili virus SARS-CoV-2 u nizu staničnih linija. Vero stanična linija, o kojoj smo pisali, pokazala se kao najbolja linija za rast ovog virusa. Više o tome kako se virus SARS-CoV-2 uzgaja i dokazuje možete pročitati u referenci 7 koja vam je u cijelosti dostupna. Kineska tvrtka Sinovac kreirala je cjepivo od inaktiviranog virusa SARS-CoV-2 uzgojenog na Vero staničnoj liniji.
Slika: SARS-CoV-2, elektronska mikroskopija. Strelice pokazuju virusne čestice u ljudskim stanicama, preuzeto iz reference 3.
1. Br Med J. 1965 Jun 5;1(5448):1467-70.
2. Science. 1989 Apr 21;244(4902):359-62.
3. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382(8):727-733.
4. J Korean Med Sci. 2020 Feb 24; 35(7): e84.
5. Lancet Infect Dis. 2020 Jun;20(6):697-706.
6. Emerg Infect Dis. 2020 Sep;26(9):2054-2063.
7. Virology. 2020 Sep; 548: 39–48.
5/5