Kako to da jednodozno cjepivo nema konzervans a traje više godina?

Prelaskom na jednodozna cjepiva otvorila se mogućnost da cjepiva doista i budu bez konzervansa – cjelokupna doza sadržana je u jednoj šprici ili drugom obliku. I dok su konzervansi u višedoznim cjepivima katkad izvor nepotrebnih strahova, istovremeno se rađa drugi strah. Tko garantira da je proizvod sterilan?

Prvo trebamo naučiti kako nisu samo živi mikroorganizmi problematični. Čak i mrtvi, raspadnuti mikroorganizmi mogu biti problematični zbog endotoksina. 

Endotoksini aktiviraju imunološki sustav i mogu izazvati porast tjelesne temperature. Zbog toga ih ispitujemo. No, krenimo od početka.

Uvjete sterilnosti proizvodnje omogućuje današnja visoka tehnologija. Već smo pisali kako u mjestima gdje se proizvode cjepiva odnosno njihov sadržaj posebno izoliran odnosno klase A. U klasi A broj čestica od 500 nanometara ne smije biti veći od 3200 u kubnom metru, a broj čestica od 5 mikrometara ne smije biti veći od 20. U uobičajenom prostoru doma ili radnog mjesta imate obično više od 5 milijuna čestica veličine 500 nanometara. U prostoru klase A broj mikroorganizama u kubnom metru zraka mora biti manji od jedan odnosno tehnički ih niti nema. Kod kuće ili vani broj mikroorganizama u zraku je vrlo velik. Tijekom svake proizvodnje kontinuirano se prati broj čestica i mikroorganizama.

Ovakvi uvjeti proizvodnje postoje zahvaljujući HEPA i ULPA filterima. HEPA dolazi od engleskog naziva High Efficiency Particulate Air, što znači da su vrlo efikasni u filtriranju zraka. ULPA je skraćenica od riječi Ultra Low Penetration Air. Prašina, spore plijesni, bakterije i sve drugo ostat će na HEPA ili ULPA filterima. No, ispitivanje same atmosfere koju stvaraju u klasi A nije dovoljno. Redovno se provjerava efikasnost tih filtera česticama standardizirane veličine, a jedan od poznatih testova je DOP test (dispersed oil particulate) gdje se ispituje sposobnost filtriranja malenih čestica ulja. U većini industrije postoji zaseban tehnički odjel čiji zaposlenici se bave samo održavanje ovakvih uvjeta proizvodnje.

Drugi stup osiguranja sterilnosti predstavlja primjena dezinficijensa u radnim prostorima. Zaboravite 70% etanol kojeg svi poznajete, u industriji obično moramo koristiti drugačije klase. Postoji jasno pravilo da se dezinficijensi moraju redovno rotirati odnosno mora se mijenjati kemijska klasa dezinficijensa u određenim vremenskim intervalima. 

Zašto? Zato da se mikroorganizmi ne bi naviknuli na određeni tip dezinficijensa. Ako se u proizvodnji radi o uzgoju bakterija koje stvaraju spore (tetanus, difterija, antraks) tada se moraju koristiti dezinficijensi koji djeluju protiv spora. No, dezinficijensi se neće koristiti s dijelovima i posudama koje dolaze u kontakt s proizvodom kako bi se izbjeglo da ostavljaju rezidue (ako ostavljaju) odnosno da se nađu greškom u proizvodu. Za takve dijelove pobrinut ćemo se drugačijim postupcima.

Postupci zagrijavanja poznati su sustavno još od XIX. stoljeća. Koristit ćemo ponekad postupke autoklaviranja, zagrijavanja pod vodenom parom visokog tlaka. Autoklaviranje nam je potrebno kako bismo ubili najotpornije mikroorganizme, poput onih koji stvaraju spore. No, svaki put tijekom autoklaviranja moramo koristiti dokaz da su takvi mikroorganizmi ubijeni, pa se koriste posebne probe sa sporama mikroorganizama koje svaki put testiraju efikasnost ovog procesa. Dijelovi proizvodnih cijevi mogu se dezinficirati kipućom vodom za injekcije. 

Staklene ampule u koje se pune neka cjepiva prolaze postupak pirolize, postupak zagrijavanja na temperature obično preko 200 °C na kojima se endotoksin u potpunosti raspada baš kao što se ubijaju baš svi mikroorganizmi. Ne moram naglašavati da se svaki put mora to i dokazati korištenjem ampula s endotoksinima te probama koje na raznim pozicijama provjeravaju temperaturu. U slučaju da se radi o plastičnim injekcijama, sterilizacija se provodi drugim postupcima poput gama zračenja.

Svaki uređaj koji dolazi u doticaj s proizvodom (cjepivom) ima sustav CIP (clean-in-place). Umjesto da se uređaj ručno rastavi i čisti, postoji sustav čišćenja. Sve je u tom procesu razrađeno do detalja. Ispiranja se provode vodom za injekcije (ne zaboravimo kako je voda za injekcije ultra pročišćena voda koja je i vrlo skupa), a sami ispirci se redovno analiziraju na niz parametara – mikrobiološki, na već spomenute endotoksine ali i na kiselost, prisustvo iona te tzv. TOC, ukupni organski ugljik. TOC je indikator dobrog čišćenja kako ništa ne bi zaostalo u sustavu.

Sterilnost proizvoda osigurava i još jedan tehnološki proces. To je sterilna filtracija. Kako su cjepiva uglavnom tekućine ili se tekućine koriste u njihovoj proizvodnji, postoje posebni filteri s porama manjim od mikrometra. Vrlo često se koriste oni s porama veličine 0,2 µm. Gotovo sve bakterije veće su od ovih pora i zaostat će na filteru. Efikasnost sterilne filtracije redovno se kontrolira. Za to se koriste standardizirani maleni mikroorgamizmi poput Brevundimonas diminuta. Na filtere se nanese točno određena količina mikroorganizama po površini filtera i nakon filtracije tekućina mora biti sterilna odnosno uklanjanje mora biti 100% efikasno. Sterilna filtracija se koristi više puta u raznim koracima proizvodnje.

Kod proizvodnje virusnih cjepiva sterilnost omogućuje i testiranje virusnih sojeva koja će završiti u cjepivu ali i ispitivanje staničnih linija. U farmakopejskom rječniku radi se od „stranim agensima“ (agents étrangers/ extraneous agents). To su bakterije poput Mycoplasma, Spiroplasma i Mycobacterium, ali i ptičji virusi kod proizvodnja na jajima ili pilećim stanicama, te testovi na retroviruse.

Mora se ispitati integritet šprica ili ampula u kojima se nalaze cjepiva kako bi tijekom skladištenja sadržaj bio izoliran od okoliša.

I na kraju, to sve treba kontrolirati. Uvijek se provodi in process kontrola odnosno kontrola tijekom proizvodnje uključujući i praćenje zraka i površina tijekom proizvodnje. Provest će se i mikrobiološka kontrola. Prema Europskoj farmakopeji obavezno se ispituje dva tipa mikroorganizama, oni koji su aerobni te anaerobni (koji ne vole kisik niti ga koriste). Zato se koristi dva tipa hranjivih medija, a u jednom se nalazi molekula tioglikolat. Tioglikolat „potroši“ kisik i omogući razvoj mikroorganizama koji ne vole kisik. 

Svaki put se mora koristiti kontrolni mikroorganizmi: 3 aerobne bakterije, jedan anaeroban i dvije gljivice. Tijekom stabilitetnih studija upravo ćemo ovom metodom dokazati kako se cjepiva „nisu pokvarila“ odnosno zagadila mikroorganizmima, bez obzira što ne sadrže konzervanse. U višedoznim cjepivima koje sadrže konzervanse cjepivo će se filtrirati sterilnom filtracijom kako bi se uklonio konzervans, a potom se će svi potencijalno zaostali mikroorganizmi na filteru ispitati u testu sterilnosti.

Kako je ponekad teško kratko odgovoriti na pitanje „Kako to da jednodozno cjepivo nema konzervans a traje više godina?“