Koji je plan protiv SARS-Cov-2?

Postavljeno nam je pitanje: kako to znanstvenici misle napraviti cjepivo protiv SARS-CoV-2 ako toliko desetljeća nisu uspjeli napraviti cjepivo protiv AIDS-a? Možda bismo mogli odgovoriti na pitanje vrlo kratko, ali bismo propustili priču o neuspjehu od koje smo puno naučili.

U šumama Kameruna u XIX. stoljeću lovci su radili ono što su radili i njihovi preci kroz tisuće godina: išli su u lov. Lovili se i primate. Ne osuđujmo olako, to su i naši preci. Jedan od lovaca je ozlijedio ruku hvatajući čimpanze, iz više manjih rana izlazila je krv, krv koja se pomiješala s krvi čimpanze. Naš lovac nije tada znao što mi znamo. Čimpanza je bila oboljela od SIV-a, virusa. SIV (virus imunodeficijencije u majmuna) nije bio agresivan kao ebola, o ne. On je polagani retrovirus koji može dugi niz godina živjeti u životinja. 

SIV virus nije patogen za čovjeka, neko vrijeme on može živjeti u čovjeku pa nestati. Francuski su znanstvenici to kasnije dokazali među plemenima u Africi i u XX. stoljeću i spontani prijenos zbiva se i dan danas. Ono što našeg lovca čini posebnim nije on sam, već SIV koji je došao u njega. SIV lako mutira i baš u njemu je nastalo nekoliko mutacija koji mu je omogućio da čovjek postane – domaćin. Rođen je HIV/VIH (virus imunodeficijencije ljudi).

HIV nije nastao jednim prijenosom sa majmuna na čovjeka. Bilo ih je čak pet koliko znamo. Od tri neovisna prijenosa SIVcpz virusa sa čimpanzi nastali su HIV-1 M tip, N i O. U jednom prijenosu SIVsmm virusa sa sasvim druge vrste majmuna, Cercocebus atys, nastao je HIV-2. Prijenosom SIVgor virusa s gorile nastao je HIVgor. Svi su se oni polako širili Afrikom i prošli su ispod radara.

Globalizacija je kasnije učinila svoje i bolest je postala planetarna. Primjerice, karipska pre-epidemija je buktala deset godina prije no se virus otkrio u SAD-u i Francuskoj. Zanimljivo, tipovi N, O i HIVgor identificirani su baš u pacijenata iz Kameruna u Belgiji i Francuskoj. Lakoća mutacije tog virusa je doista nepodnošljiva; iz M tipa nastalo je niz podtipova spontanim mutacijama kroz niz generacija virusa. Tip M je najprošireniji svjetski tip. U tom i jest problem – kako naći cjepivo za virus koji vrlo brzo mutira? To je jedan od prvih problema s kojim smo se suočili.

1984. godine Margaret Heckler, US Secretary of Health and Human Services, izjavila je kako očekuje cjepivo spremno za testiranje u roku od dvije godine. Ljudi su se uhvatili te rečenice i, baš kao i danas, prepirali oko toga. Već su tada govorili kako je to sve zavjera i kako je HIV nastao u laboratoriju i njene riječi su bile benzin na vatru tih teorija. Mnogi su pozivali na oprez. 

Dvije godine kasnije Anthony Fauci, čovjek kojeg ste upoznali tek sada preko medija, upozorio je kako cjepivo možda i nikada neće biti nađeno. Mudri Fauci je oprez argumentirao tada slabim poznavanjem imunološkog odgovora protiv HIV-a.

Znanost je tada radila najbolje što je mogla. Ne zaboravimo – izolacija DNK je tada trajala i više od dva dana (ovisno o tipu DNK), danas se to radi u roku nekoliko desetaka minuta. Mnoge tehnike koje danas poznajemo, kao što su umnožavanje DNK i efikasna sekvenciranja DNK (deep sequencing) nisu još postojale. No, imali smo puno toga. Znali smo raditi atenuiranje, „utišavanje“ i već smo imali cjepiva protiv ospica, rubeole i parotitisa. 

Osamdesete su bile godine rekombinantnih proteina i prvo rekombinantno cjepivo protiv virusa hepatitisa B odobreno je 1986. godine. Znali smo napraviti fuzijske viruse koji bi se potencijalno koristili u cjepivima. Oruđa su postojala, tražili smo teoretski koncept u praksi.

U prvoj fazi najviše smo očekivali od humoralnog odgovora odnosno imuniteta posredovanog protutijelima i efikasnost smo mjerili nastankom protutijela. Olako izrečena tvrdnja Margaret Heckler ipak je bila proročka. Prva klinička studija doista je započela 1986. godine u današnjem Kongu. 

Tvorac cjepiva bio je Francuz Daniel Zagury iz L’université Pierre et Marie Curie. Za ono vrijeme to je cjepivo bilo nevjerojatno vizionarsko. Zagury je htio postići i dobar humoralni odgovor protutijelima ali i stanični odgovor. Njegova ideja tek će kasnije dobiti na važnosti. Kao cilj odlučio je odabrati protein HIV-a gp160. Od proteina gp160 nastaju u tijelu dva manja proteina (gp120 i gp41) koji omogućuje ulazak HIV-a u stanicu. Ideja je bila razumna – da imunološki sustav spriječi ulazak virusa u stanicu. 

Zagury će gen za gp160 ugraditi u vektor – vakcinija virus. Vakcinija virus je potomak virusa kravljih boginja koje je koristio Jenner u cijepljenju protiv velikih boginja (variole), a sam je omogućio eradikaciju velikih boginja na planeti. Zagury će isprobati cjepivo na samom sebi, no njegova studija past će u zaborav. Dizajn kliničke studije je bio loš, odabirani su i pojedinci s uznapredovalom HIV infekcijom koji su bili ozbiljno imunokompromitirani. Jedan ispitanik je zbog toga umro, a kasnije se vidjelo kako su u studiji učestvovala i djeca. Zagury je s razlogom bio kritiziran.

Sljedeći je bio pristup rekombinantnim proteinima – gp160 gp120 koji, podsjetimo, omogućuju ulazak virusa u stanicu. Korištene su razne tehnologije, od kvasca, insekt stanica pa sve do stanica sisavaca i tvrtke poput Pasteur Mérieux Connaught, Chiron, MicroGeneSys i Immun AG utrkivale su se u razvoju. Sve takve studije bile su razočaranje. 

Cjepiva bi bila uglavnom sigurna, izazivala bi nastanak protutijela ali ta protutijela nisu bila efikasna. Ne bi nastajao zaštitni imunitet. Klinička faza III (efikasnost) VaxGen-ovog cjepiva s rekombinantnim gp160 započela su 1998. godine i trajala su dugih napornih pet godina, sve do 2003. godine. Cjepivo nije štitilo od infekcije. Postojale su neke naznake efikasnosti u žena i crnačke populacije ali su razlike probudile više kontroverzi nego nade. Zašto? Virusa HIV-a i njegova braća retrovirusi iznimno su lukavi. 

Evolucijski su dizajnirani da godinama ili desetljećima inficiraju jednog domaćina i uspješno izbjegavaju imunološki odgovor. Ključni proteini koji omogućuju ulazak u stanicu zaštićeni su šećerima vezanim na protein, odnosno kažemo da su glikozilirani. Tako vezani šećeri mogu spriječiti vezanje protutijela i njihovu efikasnost. I drugi mehanizmi štite proteine, primjerice mijenjanje trodimenzionalne strukture proteina. Očito smo morali poraditi na drugom segmentu imunološkog odgovora – stanična imunost. Specifična stanična imunost je sposobnost CD8+, citotoksičnih limfocita, da ubije zaražene stanice i znanstvenici su uočili kako je stanična imunost bitna u kontroli HIV infekcije. Rješenja su morala biti kreativnija.

Probali smo se fokusirati. Devedesetih godina već smo znali identificirati epitope, dijelove proteina na koji se vežu protutijela. Otkriven je segment gp160 nazvan V3 loop odnosno V3 petlja. Kako postoji dva tipa virusa HIVa, a kako je HIV-1 iznimno varijabilan, htjeli smo postići mogućnost da s različitim epitopima „pokrijemo“ različite podtipove. Na žalost, pokazalo se kako v3 petlja nije najbitniji segment i kako i druge dijelove gp160 napadaju naša protutijela. Taj put bio je slijepa ulica.

Probali smo koristiti inaktivirane viruse. Nisu novost – inaktivirani virusi čine neka cjepiva protiv dječje paralize i bjesnoće i s njima već imamo puno iskustva. Prvi rezultati u makaki majmunima bili su impresivni – stanice zaražene HIV-om su inaktivirane tvarima poput formaldehida i štitile su majmune od infekcije. Ubrzo su znanstvenici vidjeli kako je to nespecifičan proces i kako to neće funkcionirati u ljudima. Odustali smo od ovog pristupa.

Postavilo se pitanje možemo atenuirati virus HIV-a. Naravno da smo i to probali. Kako je HIV bio (i ostao) masovna epidemija, znanstvenici su našli spontane, prirodne, mutante virusa koji nemaju jedan mali protein koji se zove nefNef-negativni HIV-1 je izazivao infekciju ali nije vodio u AIDS, odnosno pad imunog sustava. Nađen je potencijalni zlatni rudnik, spontano atenuirani virus. Vrlo je teško objasniti funkciju nef proteina bez puno molekularnih detalja, pa je najlakše zapamtiti jednu priču – kako nef protein služi za pretvaranje CD4 stanica, imunoloških stanica koje napada HIV, u – zombije. 

Njima slabi njihova imunološka funkcija, ali ne umiru već postaju poligon za umnožavanje virusa, živi zombiji. Na žalost, kasnije smo vidjeli da pacijenti s nef-negativnim HIV-om ipak imaju probleme s imunološkim sustavom i taj smo korak atenuiranja zatvorili kao mogućnost (za sada).

Ponovo smo se vratili na ideju virusnog vektora ali su znanstvenici odlučili uzeti drugačiji vektor, adenovirusni vektor. Adenovirus je drugačiji tip virusa koji snažno potiče staničnu imunost. Nastalo je cjepivo MRKAd5 HIV-1gag/pol/nef koji sadrži čak tri gena HIV-a protiv čijih proteina čovjek može stvoriti imunološki odgovor. Studije faze IIb (gdje se mjerila efikasnost u prevenciji novih zaraza) u niz zemalja Južne Amerike i Afrike ali i Australije, SAD-a i Kanade započele su 2004. godine. 

Sve su naglo prekinute 2007. godine kada je analiza pokazala kako u nekih pojedinaca povećava rizik zaraze. Ovog puta je bio kriv vektor. Ad5 adenovirus nije novost u našoj biologiji i dio ljudi je već imao protutijela protiv ovog virusa (jer su ga preboljeli bez težih simptoma). Ljudi koji su preboljeli, imali bi veći rizik jer su odmah „napadali“ već poznati antigen, Ad5 virus. Ovo je bio šok za sve jer se puno od tog cjepiva očekivalo.
Što je bilo s prvim pristupom koji je započeo Daniel Zagury? Nismo ga zaboravili, rekombinantni proteini i adenovirusni vektor su bili samo jedan smjer. 

Bristol Myers-Squibb/Oncogen stvorio je virus vakcinije s gp160 i cjepivo je budilo puno nade, zvalo se HIVAC-1e. Therion Biologics Corporation odlučili su se na druge ključne proteine virusa – env i gag/pol gene u istom vektoru. Slabost originalnog vakcinija virusa što je potencijalno opasan imunokompromitiranim pacijentima. Korišteni su i drugi daleko sigurniji vektori koji su nastali dodatnim atenuiranjem (utišavanjem). To su bili NYVAC i modificirani vakcinija Ankara virus (MVA). Kao vektor je korišten i canarypox virus (zaštićenog naziva ALVAC). 

Zašto živi vektor? Htjeli smo postići što bolji imunološki odgovor uključujući i staničnu imunost. Znanstvenici su probali oba pristupa zajedno– i rekombinantni protein i „živi“ ali sigurni virusni vektor. Čak 76 kliničkih studija koristilo je kombinaciju rekombinantnih i živih cjepiva s virusnim vektorima. Konačno, 2009. godine došla je zraka Sunca. Zajednička suradnja francuskih, tajlandskih i američkih znanstvenika urodila je plodom, kliničkom studijom RV144. U toj studiji korištena je kombinacija ALVAC virusa i rekombinantnih proteina (tzv. prime-boost protokol). Uočena je zaštita od tridesetak posto. Slabost tog pristupa je bio je postotak (tridesetak posto nije spektakularno) a i zaštita je slabila tijekom vremena.

RV144 studija jasno potvrdila kako protiv lukavog virusa trebamo koristiti kombinaciju i protutijela i stanične imunosti, ali nismo uspjeli doći do svetog grala – imunološkog odgovora koji bi štitio od svih podtipova HIV-a i to s efikasnošću. Nikada nitko od svih tih pokušaja nije zaradio ništa. Ponekad gledamo tržište gotovih lijekova, nikada ne gledamo cijenu pokušaja i za tvrtke i državne institute. Doslovce stotine tisuće znanstvenika i godine njihovog rada – bez uspjeha. O tim temama rijetko kada pričamo.

HIV se štitio varijabilnosti (mutacijama), glikozilacijom proteina, ugradnjom u DNK čovjeka; drugim riječima na razne kreativne načine. Takvi su retrovirusi gdje pripada HIV, prilično biološki lukavi, dizajnirani da budu dugo godina neprimjetni. Nisu srećom sve virusne obitelji toliko lukave kao retrovirusi.
Je li sve otišlo u vjetar, od vremena do novaca? Ne. Našli smo efikasne lijekove koji nisu cjepiva i s njima držimo situaciju pod kontrolom. Priča o njima je jednako impresivna i velika. Mobilizirale su se udruge koje su od osamdesetih govorile o prevenciji, sigurnom seksu, korištenju sterilnih igli kod ovisnika o drogama, govorilo se o odgovornosti. Imali smo sreće, usprkos otporima nije postojala takva histerija kao što danas postoji protiv maski. Ljudi su bili koliko toliko odgovorniji. 

Ipak, neki su tvrdili kako su pore u kondomu veće od virusa, kako je to neugodno; jedino se nije spominjalo toplo vrijeme i disanje. Poznata vam je ta priča? Postojali su, i postoje, oni koji negiraju HIV. Poznato vam je i to? Ta priča podsjeća i na današnje doba, samo je danas pojačana društvenim mrežama kojih tada nije bilo. Među poznatim „HIV-denialistima“ najpoznatiji je bio veliki stručnjak Peter H. Duesberg koji je javno napadao Luc Montagniera da nikada doista nije izolirao virus. 

Ironijom sudbine Luc Montagnier će i sam imati svoj obol kod lažnih vijesti oko SARS-CoV-2. Otkriće DNK sekvenci u čovjeku koji sliče na virus HIV-a davali su neko vrijeme vjetar u leđa „HIV-denialista“ sve dok nismo shvatili kako se radi o endogenim retrovirusima koji čine 8-10% naše DNK. Između endogenih retrovirusa i HIV-a postoji jasna razlika – HIV je virus koji je zarazan i opasan, endogeni retrovirusi su zarobljeni „ožiljci“ infekcija koje su se desile pred nekoliko milijuna godina i neki su čak ostavili korisne gene nama i drugim vrstama. Sociološki fenomeni se ponavljaju, malo toga nas iznenađuje.

Da li je sve otišlo u vjetar neuspjehom razvoja cjepiva protiv HIV-a? Nije. Ogromno iskustvo smo stekli u istraživanju– od virusnih vektora koji su doveli do cjepiva protiv ebole, do novih adjuvansa. Da, protiv SARS-CoV-2 virusa možda isto nećemo naći cjepivo. Osobno me ne oduševljavaju medijski natpisi, samo će studije pokazati realnost. Drugačiji tip virusa, nešto manje lukav od HIV-a i manje kompleksne biologije od HIV-a, budi nam realnu nadu da je moguće. 

Možda će se naći neki drugi lijek, tko zna? Ali znanja neuspjeha HIV cjepiva ugrađena su u istraživanja i novih cjepiva i drugih lijekova i da, radimo to brže. Od vremena kada sam prvi put kročio u laboratorij znanost je otišla daleko dalje i brže.

Zahvaljujem na vašem vremenu u čitanju članka. Sve su danas emocije, a ponajmanje ima razumijevanja. Možda nikada niste čuli ovako ispričanu priču jednog neuspjeha iz kojeg smo učili. Na ovoj slici nije kriv ni čovjek niti majmun. Živimo na planetu mikroorganizama i virusa, u njemu smo samo učesnici.

Reference:
Clin Microbiol Rev. 2013 Jul; 26(3): 448–461.
Vaccines (Basel). 2013 Dec; 1(4): 513–526.
Vaccine. 2013 Aug 2;31(35):3502-18.
5/5
Podijelite dalje

dr.sc. Stribor Marković mag.pharm.

1992. godine upisujem studije medicinske biokemije na Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu. Nakon završene četiri godine studija odlučujem upisati i studij farmacije. Svoj tadašnji znanstveni interes imao sam prilike razviti radeći kroz dvije godine diplomski rad kod dr. Blaženke Grahovac i cijelom tadašnjem timu Hrvatskog zavoda za transfuzijsku medicinu u čijem sam laboratoriju imao prilike napraviti svoje prve korake. Diplomirao sam na temu molekularnog određivanja vrste Borrelia burgdorferi sensu lato u kliničkim uzorcima. Zahvalan sam i drugoj mentorici, profesorici Marici Medić-Šarić na gotovo majčinskoj podršci i na prvoj znanstvenoj publikaciji. 1998. godine diplomirao sam oba studija i stekao titule magistra farmacije i diplomiranog inženjera medicinske biokemije. Vrlo kratko sam 1998. godine radio kao asistent na zavodu za organsku kemiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta, a već iste godine zapošljavam se u istraživačkom institutu PLIVA d.d. čiji sam stipendist bio dvije godine. Počeo sam raditi kao istraživač u grupi koja se bavila istraživanjem novih protuupalnih lijekova kod dr. Mladena Merćepa. Njemu sam zahvalan, kao i svim kolegama, na svemu što sam naučio u znanosti, a toga je bilo puno. Biram li između istraživanja u industriji i akademskom okružju odabirem industrijsko okružje. Plod toga je nekoliko znanstvenih publikacija i više patenata. Postajem direktor istraživačkog programa u PLIVA d.d., a potom i voditelj stanične biologije u GlaxoSmithKline (GSK). Teško je nabrojati sve što sam prošao u znanstvenom iskustvu, od in vivo modela, molekularne i stanične biologije i niza tehnika. Smatram to privilegijom jer današnji koncept znanosti u industriji katkad više ograniči ljude nego im daje slobode. Više se ne smatram istraživačem i znanstvenikom, premda je, tko zna, jednom moguće da se vratim na taj posao. Ne volim ni da me tako zovu jer se ne volim krivo predstavljati. Kao prilog svoje povijesti prilažem listu radova. Ipak, ta povijest posla mi je dala puno vrijednog i zahvalan sam nekima omraženoj farmaceutskoj industriji na svemu što znam. 2005. godine postao sam doktor farmaceutskih znanosti s temom disertacije „Konjugati makrolida i glukokortikoida kao nova klasa protuupalnih lijekova.“ 2011. godine igrom neobičnog slučaja zaposlit ću se u Imunološkom zavodu d.d. najprije na Zavodu za transfuzijsku medicinu, a potom i kao direktor kvalitete. Bez obzira na težinu, to mi je bila velika privilegija i naučiti suptilnosti kontrole kvalitete cjepiva i proizvoda ljudske plazme obogati čovjeka za nivo striktnosti u kvaliteti koju druge grane industrije jedva dosežu. Bila mi je teška odluka otići i dan danas mi je žao te institucije i predivnih kolega koje sam tamo upoznao. Gdje su tu eterična ulja i biljke? Bezazleni tečaj aromamasaže u Aromari 2001. godine na kraju se pretvorio u hobi i interes. Zahvalan sam svojoj tadašnjoj tvrtki da je to bez problema ne samo tolerirala već su me i neki kolege ohrabrivali. Stekao sam samo jednu impresiju: svijet ljekovitih biljaka i eteričnih ulja je kaotični divlji Zapad u odnosu na striktnost svijeta farmaceutske industrije. U njemu ima potencijala koji treba razviti. Vremenom, to mi je postao moj glavni posao. Trebao sam položiti test i vlastite naivnosti i vremenom sam izgradio sve jasniji stav što je u tom svijetu prirodnih tvari i lijekova smisleno, a što je odnijela povijest. Svijet New Age-a ostavio je gorke uspomene na svijet „alternative“ i o tome trebam jednom napisati knjigu. Moj interes prema biljkama proširio se davno u svijet kozmetike, ali osobno ružno iskustvo dr. Stribor kozmetike udaljilo me još prije 3 godine od tog svijeta. Što sam znao, prenio sam na Plantageu kao mali hommage tom vremenu. Ako ikada nadrastem to gorko iskustvo ovaj interes, barem u smislu hobija, možda će se vratiti. Da bi se to desilo, ono staro prvo mora umrijeti, ali o tome više ne odlučujem ja. Moj današnji svijet je uvijek podređen osobnom učenju i iskustvu. Savjetujem pacijente i drago mi je što sam uopće prvi u struci razvio takav koncept koji je dio posla XXI. Stoljeća. Zahvaljujem se Atlantic Farmacia na uspješnoj suradnji kroz godine. Educiram puno druge i iz povijesti svojih prethodnih poslova pokušavam prenijeti svoja iskustva drugima i poraditi na općem znanju ne samo medicinskih djelatnika već cijelog društva. Aktivno pišem na Facebooku, izdao sam knjigu koja je plod tog pisanja, u grupi Samoniklog jestivog bilja, ali i u grupi Cijepljenje/vakcinacija – grupa za sve koji imaju pitanja i nedoumice, čime se zahvaljujem Imunološkom zavodu. Znam biti težak, premda sam uglavnom blagog karaktera. Tvrdoglav sam, ponekad prednost, katkad mana. Tko me povrijedio/la i financijski iskoristio/la, zauvijek ima zatvorena vrata. Nisam zlopamtilo osim u ekstremima kojih, srećom, nema puno. Na prste dvije ruke. Volim planinariti, to već mnogi znaju. Volim biljke ali i sve prirodne znanosti. Govorim francuski i engleski jezik. Više na: https://www.plantagea.hr/o-meni/