Lajmska bolest
1975. godine u okrugu gradića Lyme i Old Lyme u Connecticutu liječnici su zamijetili pravu eksploziju artritisa koji je bio u početku dijagnosticiran kao juvenilni reumatoidni artritis. Liječnicima je odmah bila sumnjiva epidemiologija te bolesti koja je više sličila na zaraznu, a daleko manje na imunološku bolest. Povjesničari medicine slične su opise našli još u XVIII. stoljeću.
Spirohete su grupa bakterija koja su ušla duboko u opću ljudsku kulturu. Tko nije čuo za sifilis, uz AIDS/SIDA najpoznatiju spolno prenosivu bolest? Sifilis uzrokuje bakterija karakterističnog izgleda uzvojnice/spirale, Treponema pallidum. Liječnik Allen Steere počet će liječiti „Lyme artritis“ antibioticima s uspjehom. To je upućivalo na bakterijski uzrok bolesti i osamdesetih godina iz pacijenata je izolirana spiralna bakterija koja će kasnije dobiti ime Borrelia. Rod Borrelia pripada istoj velikoj skupini kojoj pripada i Treponema pallidum.
Tako smo naučili kako je Lyme borelioza ili Lajmska bolest zarazna bolest koju prenose krpelji. Borrelia je rod s više vrsta i bolesti u ljudi najčešće izazivaju sljedeće vrste: : Borrelia burgdorferi, B. afzelii, B. garinii i B. bavariensis. Lajmska bolest može izazvati kožne upalne promjene (erythema migrans, acrodermatitis chronica atrophicans, lymhocytoma cutis). Vidljivi kožni oblik je najbolji scenarij jer omogućuje brzu intervenciju antibioticima. Prođe li infekcija nezapaženo, javit će se posljedice na drugim organima: neuroborelioza, upala srčanog mišića te zglobova. Simptomi se mogu javiti i nekoliko mjeseci nakon infekcije.
Neuroborelioza može se manifestirati sa simptomima sličnim multiploj sklerozi. Mogući je i razvoj posebnog sindroma, PTLDS (post-treatment Lyme disease syndrome; sindrom Lajmske bolesti nakon liječenja) s tipičnim simptomima umora, smanjenja intelektualnih sposobnosti, nesanice koji traju i duže vrijeme nakon liječenja antibioticima.
Antibiotici jesu efikasni protiv vrsta Borrelia, no postoji nekoliko problema. Jedan od njih je spora dioba: tzv. doubling time, vrijeme dupliciranja broja, je čak 24-48 sati, što može potencijalno smanjiti efikasnost antibiotika. Najčešće se koriste antibiotici poput doksiciklina i azitromicina. Učestalost bolesti ovisi o broju zaraženih krpelja u određenom prostoru. Usprkos antibioticima, bolest predstavlja veliki problem jer se ljudi mogu zaraziti više puta a bolesti su izloženi i povremeni izletnici, planinari, lovci, šumski radnici i svi koji odlaze u prirodu. Stoga je logično da smo priželjkivali cjepivo.
Priča o nastanku cjepiva je duga i poučna.
Priča o nastanku cjepiva je duga i poučna.
Pred rodom Borrelia u evoluciji se našao niz velikih bioloških izazova. Vrste koje nas zanimaju imaju niz domaćina, od sisavaca i gmazova do krpelja. Biologija krpelja i sisavaca/gmazova je vrlo različita i borelije su morale naći način adaptacije na život u obje skupine životinja. Za to su se dobro oboružale. Borelije imaju neobičnu genetsku strukturu od DNK molekule koja nije kružna kao u mnogim bakterijama, već je linearna. Sadrži i više desetaka plazmida, manjih fragmenata DNK koje bakterijama daju dodatna nova svojstva/gene koji joj omogućuju bolje preživljavanje i adaptaciju. Broj plazmida u borelijama je impresivan u odnosu na mnoge druge vrste i vjerojatno su i nastali zbog potrebe bakterije da prelazi s vrste na vrstu.
Borelije se prilagođavaju i danas znamo puno mehanizama koji ne bi stali u ovaj članak, ali spomenut ćemo jedan bitan primjer. U svojoj membrani sadrže posebne proteine koji se zovu osp. Osp je skraćenica za outer surface protein, vanjski protein na površini. OspA i ospB proteini su bitni jer omogućuju život bakterije u probavnom sustavu krpelja – oni ih doslovce „zalijepe“ u probavnom sustavu krpelja. U trenutku kada krpelj počne sisati krv, dolazak krvi započet će kaskadu procesa. Smanjivat će se ospA i ospB proteini koji su držali borelije usidrene u probavnom sustavu krpelja.
Slobodne borelije tada krenu prema ustima odnosno pljuvačnim žlijezdama krpelja i prema svom novom domaćinu – sisavcu ili gmazu, što može biti i čovjek. I u sisavcima će se nastaviti ples raznih proteina koji će se „uključivati“ i „isključivati“ po potrebi.
Borelije se prilagođavaju i danas znamo puno mehanizama koji ne bi stali u ovaj članak, ali spomenut ćemo jedan bitan primjer. U svojoj membrani sadrže posebne proteine koji se zovu osp. Osp je skraćenica za outer surface protein, vanjski protein na površini. OspA i ospB proteini su bitni jer omogućuju život bakterije u probavnom sustavu krpelja – oni ih doslovce „zalijepe“ u probavnom sustavu krpelja. U trenutku kada krpelj počne sisati krv, dolazak krvi započet će kaskadu procesa. Smanjivat će se ospA i ospB proteini koji su držali borelije usidrene u probavnom sustavu krpelja.
Slobodne borelije tada krenu prema ustima odnosno pljuvačnim žlijezdama krpelja i prema svom novom domaćinu – sisavcu ili gmazu, što može biti i čovjek. I u sisavcima će se nastaviti ples raznih proteina koji će se „uključivati“ i „isključivati“ po potrebi.
Usprkos činjenici da se smanjuje broj ospA proteina tijekom prijenosa s krpelja na sisavce, uočeno je kako protutijela protiv tog proteina sprječavaju zarazu. U dovoljnom titru (količini) u krvi, protutijela bi ušla krvlju u probavni sustav krpelja i vezala se za borelije. Na taj način bi spriječila infekciju ljudi. Postigli bi ono što antibiotici ne mogu – djelovat ćemo preventivno.
Devedesetih godina sve je bilo spremno. Postojalo je već dugotrajno iskustvo s rekombinantnim cjepivima koje je započelo cjepivom protiv virusa hepatitisa B. Znanstvenici su gen za OspA protein Borrelia burgdorferi sensu stricto ZS7 prebacili u bakteriju Escherichia coli i – voilà – rođen je rekombinantni protein. 30 mikrograma tog proteina vezan je za 0,5 mg aluminij-hidroksida i rođeno je cjepivo LYMErix. U fazi II kliničkih studija uspješno je poticalo stvaranje protutijela, a u fazi III, dano u tri doze s razmakom, štitilo je od infekcije borelijama s efikasnošću od 78%. U fazi II i III nije bilo opaženih negativnih reakcija osim već očekivanog crvenila, otoka i boli na mjestu aplikacije cjepiva.
Devedesetih godina sve je bilo spremno. Postojalo je već dugotrajno iskustvo s rekombinantnim cjepivima koje je započelo cjepivom protiv virusa hepatitisa B. Znanstvenici su gen za OspA protein Borrelia burgdorferi sensu stricto ZS7 prebacili u bakteriju Escherichia coli i – voilà – rođen je rekombinantni protein. 30 mikrograma tog proteina vezan je za 0,5 mg aluminij-hidroksida i rođeno je cjepivo LYMErix. U fazi II kliničkih studija uspješno je poticalo stvaranje protutijela, a u fazi III, dano u tri doze s razmakom, štitilo je od infekcije borelijama s efikasnošću od 78%. U fazi II i III nije bilo opaženih negativnih reakcija osim već očekivanog crvenila, otoka i boli na mjestu aplikacije cjepiva.
Nakon ulaska na tržište i početka kampanje cijepljenja započele i dobre i loše vijesti. Dobra vijest je bio pad obolijevanja od Lyme borelioze. Loša vijest je bila prijava nuspojava od kojih je najčešća bila – artritis. Tako ozbiljnom problemu uvijek se ozbiljno pristupa, FDA je ponovo revidirao svaki detalj faze III studije, od proizvođača je zatraženo kliničko istraživanje.
U oba pravca nije nađena statistička povezanost, cijepljene i necijepljene grupe imale su istu incidenciju razvoja artritisa. Ipak, zaredale su se privatne tužbe i zahtjevi za odštetom te medijski natpisi. Proizvođač na kraju nije morao platiti odštete (osim povelike cifre za plaćanje odvjetničkih ureda), ali šteta je bila napravljena. 2002. godine povučeno je cjepivo, a konkurent, Pasteur Mérieux Connaught, koji je napravio slično cjepivo odlučio je ne registrirati cjepivo usprkos uspješnoj fazi III.
U oba pravca nije nađena statistička povezanost, cijepljene i necijepljene grupe imale su istu incidenciju razvoja artritisa. Ipak, zaredale su se privatne tužbe i zahtjevi za odštetom te medijski natpisi. Proizvođač na kraju nije morao platiti odštete (osim povelike cifre za plaćanje odvjetničkih ureda), ali šteta je bila napravljena. 2002. godine povučeno je cjepivo, a konkurent, Pasteur Mérieux Connaught, koji je napravio slično cjepivo odlučio je ne registrirati cjepivo usprkos uspješnoj fazi III.
Znanstvenici su krenuli istraživati postoji li realnost nastanka ovakve nuspojave. Pronašli su djelomični odgovor u posebnoj skupini pacijenata, tzv. „treatment resistant Lyme“ odnosno Lyme artritis koji se nije uspješno liječio antibioticima. Infekcija borelijom u tih je pacijenata, kao i drugih poticala stvaranje protutijela protiv ospA proteina. No, kod njih su ta protutijela mogla napadati vlastiti protein LFA-1. Nismo prvi put vidjeli takvu pojavu gdje dio bakterijskog proteina sliči na naš vlastiti protein.
Kako je cjepivo sadrži rekombinantni ospA protein, moglo se desiti da se i u takvih pacijenata razvije autoimuni proces. Znanstvenici su vidjeli kako samo manji dio pacijenata može razviti takav problematičan proces. Sve je ovisilo o jednom genu, HLA-DRB1*0401, i kojeg nosi samo dio ljudi. Nećemo ulaziti dublje u njegovu funkciju, samo ćemo reći kako je bitan u imunološkim reakcijama. Nisu se svi slagali s tim činjenicama i neke grupe nisu potvrdile nastanak ovog procesa, ali je bilo dovoljno da odredi budućnost cjepiva protiv Lajmske bolesti.
Kako je cjepivo sadrži rekombinantni ospA protein, moglo se desiti da se i u takvih pacijenata razvije autoimuni proces. Znanstvenici su vidjeli kako samo manji dio pacijenata može razviti takav problematičan proces. Sve je ovisilo o jednom genu, HLA-DRB1*0401, i kojeg nosi samo dio ljudi. Nećemo ulaziti dublje u njegovu funkciju, samo ćemo reći kako je bitan u imunološkim reakcijama. Nisu se svi slagali s tim činjenicama i neke grupe nisu potvrdile nastanak ovog procesa, ali je bilo dovoljno da odredi budućnost cjepiva protiv Lajmske bolesti.
Krenulo se sve iznova. Očito je cjepivo koje potiče reakciju protiv ospA proteina bilo uspješno. No, trebalo je izbjeći dio proteina koji nosi rizik ovakve reakcije – to je bio dio nazvan po brojevima aminokiselina (221-240). Ali, koji dio proteina uzeti a da cjepivo bude efikasno? Ovdje smo trebali koristiti tehnologiju ne XX. stoljeća već XXI. stoljeća. Da bismo razumjeli ovaj pristup morat ćemo naučiti/ponoviti par pojmova.
Prvi pojam je antigen. OspA je antigen, tvar protiv koje imunološki sustav može stvoriti imunološku reakciju, u ovom slučaju protutijelo. No, proteini su velike molekule i protutijelo neće „zagrliti“ cijeli protein. Vezat će se samo za jedan mali dio proteina. Taj mali dio za kojeg se baš veže protutijelo zove se epitop. Ideja je bila jasna – naći ćemo epitop van „rizične“ regije, uzeti njega i stvoriti cjepivo.
No, to nije jednostavno. Najprije nam je pomogla kristalografija. Kristalna struktura ospA proteina i protutijela omogućila je doznati bitnu stvar – na koji dio ospA se „zalijepi“ protutijelo. Znanstvenici su htjeli više. Kako postoji više vrsta borelija htjeli su ovog puta napraviti cjepivo koje bi štitilo od svih koje izazivaju Lajmsku bolest. Postoji ukupno šest različitih ospA proteina a kristalnu smo strukturu znali samo za jedan, nazvan ST1. Oni se razlikuju u strukturi i za ostalih pet nismo mogli znati gdje je točno to mjesto kontakta, odnosno epitop.
No, to nije jednostavno. Najprije nam je pomogla kristalografija. Kristalna struktura ospA proteina i protutijela omogućila je doznati bitnu stvar – na koji dio ospA se „zalijepi“ protutijelo. Znanstvenici su htjeli više. Kako postoji više vrsta borelija htjeli su ovog puta napraviti cjepivo koje bi štitilo od svih koje izazivaju Lajmsku bolest. Postoji ukupno šest različitih ospA proteina a kristalnu smo strukturu znali samo za jedan, nazvan ST1. Oni se razlikuju u strukturi i za ostalih pet nismo mogli znati gdje je točno to mjesto kontakta, odnosno epitop.
Znanstvenici malene francuske tvrtke Valneva i njihovi istraživači u Austriji pozvali su u pomoć – kompjuter. Ubacili su podatke u kompjuterski program – kreirali su „virtualni“ protein po uzoru na ST1 i dali kompjuteru da izračuna kao bi izgledale strukture ostalih ospA proteina. Kompjuterski programi dali su prijedlog epitopa. Kompjutersku teoriju trebalo je testirati u praksi i predloženi epitopi, fragmenti ospA proteina, su ispitani u realnim farmakološkim modelima. Kako je bilo predloženo više epitopa, odabrani su samo oni koji doista potiču imunološku reakciju.
Znanstvenici su potom spojili sve te epitope svih vrsta borelije (Borrelia burgdorferi, B. afzelii, B. garinii i B. bavariensis) u jedan protein i ponovo ispitali. Zašto nisu zasebno proizveli epitope i spojili u jedno cjepivo? Odgovor je jednostavan – to znatno poskupljuje i produžuje proizvodnju jer unosi više kritičnih koraka.
Sjetimo se kako se „6 u 1“ cjepiva proizvode i do tri godine s nepreglednim brojem kontrola i kritičnih točaka. Ovako postoji samo jedan protein i takav jedan protein izazvao je nastanak protutijela protiv svih navedenih vrsta jer sadrži epitope šest različitih antigena, ospA proteina. Priču pričam pojednostavljeno: brojni drugi molekularni detalji bili su kritični. Primjerice, protein je dodatno stabiliziran kako bi bio stabilan tijekom skladištenja. Sve što smo naučili na greškama drugih cjepiva znanstvenici Valneve su probali ispraviti unaprijed.
Znanstvenici su potom spojili sve te epitope svih vrsta borelije (Borrelia burgdorferi, B. afzelii, B. garinii i B. bavariensis) u jedan protein i ponovo ispitali. Zašto nisu zasebno proizveli epitope i spojili u jedno cjepivo? Odgovor je jednostavan – to znatno poskupljuje i produžuje proizvodnju jer unosi više kritičnih koraka.
Sjetimo se kako se „6 u 1“ cjepiva proizvode i do tri godine s nepreglednim brojem kontrola i kritičnih točaka. Ovako postoji samo jedan protein i takav jedan protein izazvao je nastanak protutijela protiv svih navedenih vrsta jer sadrži epitope šest različitih antigena, ospA proteina. Priču pričam pojednostavljeno: brojni drugi molekularni detalji bili su kritični. Primjerice, protein je dodatno stabiliziran kako bi bio stabilan tijekom skladištenja. Sve što smo naučili na greškama drugih cjepiva znanstvenici Valneve su probali ispraviti unaprijed.
Nedavno smo ove godine doznali kako je Valnevino cjepivo uspješno prošlo ispitivanje u fazi II. Slijedi mu vrlo važna faza III. U odnosu na staro cjepivo, prednost će biti što je izbjegnut „rizični“ dio ospA proteina, što će štititi od vrsta koje su prisutne i u Europi i SAD-u i time očekujemo i veću efikasnost od prethodnog cjepiva i, logično, veću sigurnost. U međuvremenu je Lajmska bolest postala problem koji povezuje pacijente i u Facebook grupe i problem te bolesti jest javnozdravstveni problem. Stoga mnogi očekuju puno od ovog cjepiva.
Svaka čast što ste izdržali priču do kraja.
Ukratko: prvi put je primijenjen sustav spajanja samo malih fragmenata šest različitih proteina, spajanja u jedan kako bi nastala imunološka reakcija šest različitih protutijela. Njihov je cilj da zaustavi borelije direktno u probavnom sustavu krpelja, prije no se prenese na čovjeka. Držimo sretnice tom cjepivu.
Ukratko: prvi put je primijenjen sustav spajanja samo malih fragmenata šest različitih proteina, spajanja u jedan kako bi nastala imunološka reakcija šest različitih protutijela. Njihov je cilj da zaustavi borelije direktno u probavnom sustavu krpelja, prije no se prenese na čovjeka. Držimo sretnice tom cjepivu.
Reference:
Infect Immun. 2020 Mar 23;88(4):e00917-19.
Epidemiol Infect. 2007 Jan; 135(1): 1–8.
FEMS Immunol Med Microbiol. 2012 Oct; 66(1): 1–19.
Front Cell Infect Microbiol. 2014; 4: 136.
Vaccine. 2017 May 31;35(24):3178-3185
5/5