Pojmovi koji zbunjuju: mutageno, karcinogeno, genotoksično – treći dio
Pojmovi koji zbunjuju: mutageno, karcinogeno, genotoksično - treći dio
U prvom i drugom dijelu priče posvetili smo vrijeme pojmovima mutacija/mutagenosti i pojmu karcinogenih tvari. Cijeli niz prirodnih i sintetskih tvari ima potencijal izazivanja tumora. Osloniti se samo na mogućnost da pratimo koje od tih tvari izazivaju tumoreu ljudima bilo bi ne-etično, ali su u prethodnim stoljećima omogućile otkriće takvih tvari. Prisjetimo se otkrića u XVIII. stoljeću da čađ iz dimnjaka izaziva tumore, a koje je temeljeno na proučavanju tumora u dimnjačara. Postavilo se pitanje možemo li doznati tu informaciju prije no takva tvar dođe u kontakt s čovjekom.
Prvo rješenje bili su modelu u životinjama, a inicijalne studije dugujemo Japancima. Godine 1918. Katsusaburo Yamagiwa i Koichi Ichikawa prvi su ispitali sposobnost neke tvari da izaziva tumore. Zamijetili su da kronično mazanje malih količina katrana na zečje uši uzrokuje nastanak tumora. Englesko-izraelski znanstvenik Isaac Berenblum svoj je profesionalni život posvetio ispitivanju karcinogenih tvari te je 1941. godine postavio osnovne postavke mehanizama kojim tvari mogu uzrokovati tumore. U to doba još nismo bili svjesni mehanizma izazivanja mutacija. Godine 1949. američki FDA prvi je u svijetu izdao obavezu ispitivanja novih tvari u hrani i lijekovima u dvije vrste životinja, jedna vrsta su glodavci poput miša, a druga vrsta nije smjela biti glodavac. To je bilo bitno zbog evolucijske i genetske udaljenosti miša i štakora od čovjeka. U početku je sve to išlo na državni trošak, a kasnije su trošak i obavezu prebacile na tvrtke.
No, životinjski modeli imaju svoje mane – to su velike, dugotrajne studije, a ispitivanje velikog broja tvari bili bi i etički dvojbeni. Trebalo je naći jednostavnije modele u kojima bismo mogli ispitati tvari prije životinja. Nakon otkrića mehanizma mutacija na molekuli DNK, stvorili su se preduvjeti za nastanak takvih ispitivanja. Prve su nam u pomoć uskočile bakterije. Bakterije rastu vrlo brzo i bilo koja mutacija može se uočiti vrlo brzo.
Ranih sedamdesetih godina XX. stoljeća tim istraživača Brucea Amesa kreirao je metodu koja će ostati u primjeni do današnjeg dana. Iz bogate zbirke bakterija odabrali su nekoliko sojeva bakterije Salmonella typhimurium. Ova vrsta bakterija inače sama stvara nutritivnu tvar, aminokiselinu histidin. No, sojevi koje su odabrali imali su mutacije u genima pomoću kojih stvaraju histidin i koje onemogućavaju ovaj proces. Zbog toga, u podlogu na kojima rastu mora se dodati histidin. Ako neka tvar uzrokuje mutacije, neke od njih mogu biti fatalne. U vrlo, vrlo malenom broju bakterija, tvar koja izaziva mutacije može mutirati gene koji su do tada bili nesposobni dati sposobnost stvaranja histidina i učiniti ih ponovno sposobnim. One tada mogu rasti na podlozi bez histidina i mi ih vidimo kao kolonije. Ako tvar nije mutagena, neće doći do tog procesa i kolonije neće narasti.
Elegantnost Amesovog testa leži u brzini – u roku jednog dana dobivaju se barem preliminarni rezultati. Različiti sojevi koji se koriste u Amesovom testu mogu čak pokazati i mehanizam mutacije. Neki mutageni mijenjaju baze – npr. ATGC će promijeniti u ACGC. Neki mutageni izbacuju baze pa će ATGC pretvoriti u ATC. Sojevi Amesovog testa specijalizirani su „reagiraju“ točno na jedan od ova dva mehanizma. Ubrzo smo naučili kako neke tvari postaju mutagene tek nakon što ih naše tijelo enzimski obradi, metabolizira (vidi dio 2 priče). Stoga se tvari obavezno ispituju i nakon što smo ih obradili enzimima iz jetre štakora ili drugih vrsta.
Amesov test nije zamjena za ispitivanja na životinjama, ali je uvelike smanjio potrebu za njima. Ne postoji znak jednakosti između mutagene tvari (tvar koja izaziva mutacije) i kancerogene tvari (tvar koja izaziva tumore). No, jako mutagene tvari doista nose visok rizik da mogu izazvati tumore.
Amesov test ima još jednu manu, a to je nespecifičnost. Neke tvari koje u životinjama i ljudima ne izazivaju tumore i mutacije, ali su pozitivne na Amesovom testu. Najpoznatiji su lijekovi koji sadrže nitro, -NO2 skupinu, poput nitroglicerina (srce) i nitrofurantoina (lijek koji se koristi kod infekcija mokraćnog mjehura). Naime, bakterije sadrže enzime koji mijenjaju nitro skupinu u tvari koje izazivaju mutacije, a životinje uopće nemaju takve enzime.
Nakon Amesovog testa razvijeni su brojni drugi. Glavna zamjerka Amesovom testu je korištenje bakterija koje su doista različite od ljudi. Mišje stanice tumora, limfoma, sličnije su ljudskim stanicama. Takve stanice nose gen za jedan enzim, timidin kinazu. Kada tim stanicama damo spoj tri-fluoro-timidin, timidin kinaza od njega napravi otrov koji ubije stanicu. No, ako ispitivani spoj izaziva mutacije, postoji šansa da će mutirati (onemogućiti) baš taj gen i stanice onda mogu rasti kada im dodamo taj samoubilački spoj. Kao i kod Amesovog testa, uočit ćemo malene kolonije mutiranih stanica koje sretno rastu.
Postoji velik broj drugih testova koje sada nema smisla nabrajati, pa sugeriram znatiželjnima da prouče reference na kraju teksta. Razvijane su metode koje su specifičnije. Usprkos tome, 30-50% tvari koje se koriste u prehrani ili lijekovima mogu dati na jednom od tih testova pozitivan rezultat mutagenosti, premda nisu opasne. Zbog toga se in vitro tehnike koriste samo kao dio slagalice, a ne kao konačna procjena opasnosti tvari. Na žalost, ovakvi podaci često budu izvorište senzacionalističkih naslova ili objava na društvenim mrežama.
Čak su ispitivanja na životinjama promijenjena i ubrzana kako bi se smanjila nepotrebna patnja. Mikronukleus test u miševa je model koji traje kratko i koji, ako tvar izaziva mutacije ili je genotoksična (definicije u kasnijim nastavcima), tijekom sazrijevanja crvenih krvnih stanica nastat će malene strukture, mikronukleusi („mikro jezgre“) koje sadrže DNK. One su vidljive pod mikroskopom.
Sva ova ispitivanja donijela su nam daleko više sigurnosti krajem XX. stoljeća. Potrebu za njima naučili smo na iskustvima u periodu prije, a koje ćemo sresti u nastavku.
Image by kjpargeter
Za naučiti više:
Vet Pathol. 2013 Mar;50(2):324-33.
Br J Pharmacol. 2011 Mar; 162(6): 1250–1258.
Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2017 Oct;13(10):1089-1098.
Food Chem Toxicol. 2017 Aug;106(Pt B):609-615.
Section 4.5 Genotoxicity – World Health Organization (WHO)
Prvo rješenje bili su modelu u životinjama, a inicijalne studije dugujemo Japancima. Godine 1918. Katsusaburo Yamagiwa i Koichi Ichikawa prvi su ispitali sposobnost neke tvari da izaziva tumore. Zamijetili su da kronično mazanje malih količina katrana na zečje uši uzrokuje nastanak tumora. Englesko-izraelski znanstvenik Isaac Berenblum svoj je profesionalni život posvetio ispitivanju karcinogenih tvari te je 1941. godine postavio osnovne postavke mehanizama kojim tvari mogu uzrokovati tumore. U to doba još nismo bili svjesni mehanizma izazivanja mutacija. Godine 1949. američki FDA prvi je u svijetu izdao obavezu ispitivanja novih tvari u hrani i lijekovima u dvije vrste životinja, jedna vrsta su glodavci poput miša, a druga vrsta nije smjela biti glodavac. To je bilo bitno zbog evolucijske i genetske udaljenosti miša i štakora od čovjeka. U početku je sve to išlo na državni trošak, a kasnije su trošak i obavezu prebacile na tvrtke.
No, životinjski modeli imaju svoje mane – to su velike, dugotrajne studije, a ispitivanje velikog broja tvari bili bi i etički dvojbeni. Trebalo je naći jednostavnije modele u kojima bismo mogli ispitati tvari prije životinja. Nakon otkrića mehanizma mutacija na molekuli DNK, stvorili su se preduvjeti za nastanak takvih ispitivanja. Prve su nam u pomoć uskočile bakterije. Bakterije rastu vrlo brzo i bilo koja mutacija može se uočiti vrlo brzo.
Ranih sedamdesetih godina XX. stoljeća tim istraživača Brucea Amesa kreirao je metodu koja će ostati u primjeni do današnjeg dana. Iz bogate zbirke bakterija odabrali su nekoliko sojeva bakterije Salmonella typhimurium. Ova vrsta bakterija inače sama stvara nutritivnu tvar, aminokiselinu histidin. No, sojevi koje su odabrali imali su mutacije u genima pomoću kojih stvaraju histidin i koje onemogućavaju ovaj proces. Zbog toga, u podlogu na kojima rastu mora se dodati histidin. Ako neka tvar uzrokuje mutacije, neke od njih mogu biti fatalne. U vrlo, vrlo malenom broju bakterija, tvar koja izaziva mutacije može mutirati gene koji su do tada bili nesposobni dati sposobnost stvaranja histidina i učiniti ih ponovno sposobnim. One tada mogu rasti na podlozi bez histidina i mi ih vidimo kao kolonije. Ako tvar nije mutagena, neće doći do tog procesa i kolonije neće narasti.
Elegantnost Amesovog testa leži u brzini – u roku jednog dana dobivaju se barem preliminarni rezultati. Različiti sojevi koji se koriste u Amesovom testu mogu čak pokazati i mehanizam mutacije. Neki mutageni mijenjaju baze – npr. ATGC će promijeniti u ACGC. Neki mutageni izbacuju baze pa će ATGC pretvoriti u ATC. Sojevi Amesovog testa specijalizirani su „reagiraju“ točno na jedan od ova dva mehanizma. Ubrzo smo naučili kako neke tvari postaju mutagene tek nakon što ih naše tijelo enzimski obradi, metabolizira (vidi dio 2 priče). Stoga se tvari obavezno ispituju i nakon što smo ih obradili enzimima iz jetre štakora ili drugih vrsta.
Amesov test nije zamjena za ispitivanja na životinjama, ali je uvelike smanjio potrebu za njima. Ne postoji znak jednakosti između mutagene tvari (tvar koja izaziva mutacije) i kancerogene tvari (tvar koja izaziva tumore). No, jako mutagene tvari doista nose visok rizik da mogu izazvati tumore.
Amesov test ima još jednu manu, a to je nespecifičnost. Neke tvari koje u životinjama i ljudima ne izazivaju tumore i mutacije, ali su pozitivne na Amesovom testu. Najpoznatiji su lijekovi koji sadrže nitro, -NO2 skupinu, poput nitroglicerina (srce) i nitrofurantoina (lijek koji se koristi kod infekcija mokraćnog mjehura). Naime, bakterije sadrže enzime koji mijenjaju nitro skupinu u tvari koje izazivaju mutacije, a životinje uopće nemaju takve enzime.
Nakon Amesovog testa razvijeni su brojni drugi. Glavna zamjerka Amesovom testu je korištenje bakterija koje su doista različite od ljudi. Mišje stanice tumora, limfoma, sličnije su ljudskim stanicama. Takve stanice nose gen za jedan enzim, timidin kinazu. Kada tim stanicama damo spoj tri-fluoro-timidin, timidin kinaza od njega napravi otrov koji ubije stanicu. No, ako ispitivani spoj izaziva mutacije, postoji šansa da će mutirati (onemogućiti) baš taj gen i stanice onda mogu rasti kada im dodamo taj samoubilački spoj. Kao i kod Amesovog testa, uočit ćemo malene kolonije mutiranih stanica koje sretno rastu.
Postoji velik broj drugih testova koje sada nema smisla nabrajati, pa sugeriram znatiželjnima da prouče reference na kraju teksta. Razvijane su metode koje su specifičnije. Usprkos tome, 30-50% tvari koje se koriste u prehrani ili lijekovima mogu dati na jednom od tih testova pozitivan rezultat mutagenosti, premda nisu opasne. Zbog toga se in vitro tehnike koriste samo kao dio slagalice, a ne kao konačna procjena opasnosti tvari. Na žalost, ovakvi podaci često budu izvorište senzacionalističkih naslova ili objava na društvenim mrežama.
Čak su ispitivanja na životinjama promijenjena i ubrzana kako bi se smanjila nepotrebna patnja. Mikronukleus test u miševa je model koji traje kratko i koji, ako tvar izaziva mutacije ili je genotoksična (definicije u kasnijim nastavcima), tijekom sazrijevanja crvenih krvnih stanica nastat će malene strukture, mikronukleusi („mikro jezgre“) koje sadrže DNK. One su vidljive pod mikroskopom.
Sva ova ispitivanja donijela su nam daleko više sigurnosti krajem XX. stoljeća. Potrebu za njima naučili smo na iskustvima u periodu prije, a koje ćemo sresti u nastavku.
Image by kjpargeter
Za naučiti više:
Vet Pathol. 2013 Mar;50(2):324-33.
Br J Pharmacol. 2011 Mar; 162(6): 1250–1258.
Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2017 Oct;13(10):1089-1098.
Food Chem Toxicol. 2017 Aug;106(Pt B):609-615.
Section 4.5 Genotoxicity – World Health Organization (WHO)
5/5