Najčešće stanične linije koje se koriste u proizvodnji virusnih cjepiva

Najčešće stanične linije koje se koriste u proizvodnji virusnih cjepiva

 
Prije čitanja članka, zamolit ću vas da pročitate Jelenin članak o staničnim linijama u cjepivima, jer ne bih ponavljao iste činjenice.
 
Virusi trebaju žive stanice i ne mogu rasti na ne-živim podlogama. Virusi su vrlo zahtjevna gospoda i neće živjeti u svakoj stanici koju im date na raspolaganju. Neki virusi napadaju samo manji broj vrsta, zbog toga postoje bolesti koje mogu napadati druge životinje, a nas ne mogu. U razvoju cjepiva najteže je bilo naći prikladnog „domaćina“ za uzgoj virusa. Navedimo primjer Louisa Pasteura koji je uzgojio virus bjesnoće na zečevima; virusi bi se umnožili u zečjoj leđnoj moždini. 
 
Da bi virologija i razvoj cjepiva napredovali trebala se razviti stanična biologija. Početkom XX. stoljeća shvatili smo kako stanice izolirane iz živih organizama mogu rasti u hranjivim podlogama, slično uzgoju bakterija.
 
Postoji nekoliko staničnih linija koje koristimo u proizvodnji cjepiva. Upoznajmo ih i proučimo njihovu povijest i biologiju.
 
Dvije ljudske stanične linije koriste se za proizvodnju cjepiva. To su WI-38 i MRC-5. To su linije čestog tipa stanica u ljudskom tijelu koje zovemo fibroblasti. U opisu se navodi da su diploidne, što, pojednostavljeno, znači da imaju normalan broj kromosoma kao i većina drugih ljudskih stanica. Neke druge stanične linije nemaju takav broj kromosoma. Već smo u grupi čitali potencijalne kontroverze jer se radi o stanicama izoliranim iz ljudskih fetusa
 
Pogledajmo objektivne okolnosti u kojima su nastali.
 
WI-38 stanična linija izolirana je iz pluća tromjesečnog ženskog fetusa iz Švedske 1962. godine. Radilo se o prekidu vrlo neželjene trudnoće i povijesna komunikacija koja nam je dostupna pokazuje kako je osoba kasnije bila u potpunosti upoznata s nastankom i korištenjem te stanične linije nastalog iz fetusa. Liniju je izolirao američki znanstvenik Leonard Hayflick u Wistar Institute for Anatomy and Biology u gradu Philadelphiji. Skraćenica WI u imenu linije dolazi od naziva instituta. 
 
Leonard je godinu dana prije opisao način dobivanja ljudskih diploidnih stanica. WI-38 stanična linija nije izolirana samo s ciljem uzgoja virusnih sojeva. Na njoj smo puno naučili o „smrtnosti“ ljudskih stanica. Naime, WI-38 stanična linija ne može se dijeliti beskonačno poput tumorskih staničnih linija. Leonard je bio darežljiv i osobno je odnio zamrznute stanice u London, tadašnji Leningrad, Moskvu i – Beograd. 
 
Nekadašnja Jugoslavija je imala privilegiju dobiti na ispitivanje vrijednu liniju koja se pokazala bitnom za razvoj cjepiva u našim krajevima. Tek nakon nekog vremena i brojnih istraživanja WI-38 se pokazala dobrom stanicom za uzgoj virusa. Neki „divlji“ virusi su „utišani“ (atenuirani) na ovoj liniji, poput virusa rubeole. Za dobivanje vrlo efikasnog i sigurnog cjepiva protiv rubeole tajna je bila u uzgoju virusa na WI-38 staničnoj liniji na 30 °C umjesto 37 °C. U neobičnom preokretu sudbine, na toj liniji nastalo je cjepivo protiv virusa koji je izazivao oštećenja fetusa i bio čest razlog prekida trudnoće.
 
MRC-5 stanična linija (Medical Research Council cell strain 5) nastala je kasnije, 1970. godine. Izolirana je iz pluća muškog fetusa. U ovom slučaju, prekid trudnoće je bio posljedica vrlo teškog psihičkog stanja 27-godišnje pacijentice o čijim se detaljima zbog privatnosti obitelji ne govori detaljno. MRC-5 linija imala je slične uvjete rasta ali je rasla nešto brže od WI-38 stanične linije što uvijek može biti praktično u istraživanju i proizvodnji.
 
Na MRC-5 i WI-38 liniji, dvjema od brojnih drugih linija izoliranih iz ljudi, mogu se uzgajati niz cijepnih virusa cjepiva protiv rubeole, vodenih kozica, ospica, bjesnoća i virus hepatitisa A. Kod nas ih nalazite navedene u uputama o cjepivima protiv morbila, parotitisa i rubeole te cjepiva protiv vodenih kozica. U cjepivima poput Priorixa i M-M-RVaxpro komponenta rubeole uzgaja se na tim stanicama. Usprkos ograničenom broju dioba tih stanica, već se desetljećima koriste i koristit će se još duže vrijeme. O strahovima oko strane DNK stranih stanica već smo bili pisali.
 
Vrlo česta linija koju susrećete u opisima je Vero stanična linija. Vero staničnu liniju izolirali su japanski istraživači Y. Yasumura i Y. Kawakita na sveučilištu Chiba. Zanimljivo, svoj rad su započeli u isto vrijeme kada je i izolirana WI-38 stanična linija a svoje rezultate prvo su objavili na japanskom jeziku 1963. godine. Znanstvenicima nisu motiv bila cjepiva, u svom originalnom radu u samom naslovu govore kako ta linija može poslužiti „u istraživanju tumora“. Vero linija imenom je inspirirana esperantom koji je tada postajao popularan: Vero znači „istina“, a skraćenica je od „verda reno“, zeleni bubreg, nazvane prema bubregu zelene majmunice (Chlorocebus sabaeus). 
 
Vero stanična linija može rasti u daleko većem broju pasaža (dioba) od ljudskih diploidnih stanica WI-38 i MRC-5. Zbog toga je zovemo kontinuirani tip linije. Nakon nekoliko godina otkrilo se kako u njoj jako dobro rastu virusi. 1981. godine francuski znanstvenici prvi su uspješno koristili Vero staničnu liniju za proizvodnju cjepiva protiv dječje paralize i ubrzo su je počeli koristiti i drugi proizvođači. Što je to čarobno u Vero staničnoj liniji? Nepoznatim spontanim procesom u Japanu došlo je do izmjene genetskog materijala. Iz 12-tog kromosoma „izletili“ su odnosno nestali ključni geni u kontekstu proizvodnje virusnih cjepiva. 
 
Prvi su bili proteini koji koče rast stanice, stoga je i linija postala kontinuirana odnosno mogla je rasti bez ograničenja. Drugi geni su bili geni za tzv. tip I interferone. Tip I interferoni stanici služe za obranu protiv virusa. Lišena tog oruđa, u stanici mogu rasti i vrlo oslabljeni virusi koji se koriste u proizvodnji cjepiva. Vero stanična linija nam služi za proizvodnju cjepiva protiv dječje paralize. Stoga Vero liniju nalazite spomenutu na uputi o cjepivima „5 u 1“ i „6 u 1“, te u inaktiviranim cjepivima protiv dječje paralize. 
 
Rotateq i Rotarix cjepiva protiv rotavirusa također se proizvode na ovoj liniji. Premda nije kod nas u upotrebi, zgodno je za navesti kako se novo cjepivo protiv virusa ebole proizvodi na Vero staničnoj liniji.
Embrionalne pileće stanice (PCEC, purified chick embryo cells) se često koriste za uzgoj virusa. Stanice se dobivaju iz pilećih embrija. Na njima uzgajamo viruse poput ospica i parotitisa u MMR/MPR cjepivima, neke od cjepiva protiv bjesnoće te viruse u cjepivima protiv virusa krpeljnog meningoencefalitisa (KME). Najveći strah kod virusnih cjepiva uzgojenih na ovoj liniji je alergija na jaje. 
 
Cjepiva uzgojena na PCEC mogu imati tragove ovalbumina, proteina bjelanjka jaja. Alergija na jaje nije kontraindikacija za cjepiva poput Priorixa ili M-M-RVaxpro i o pitanjima oko ovalbumina smo već pisali.
Postoji često strah kako te same stanice nalazimo i u cjepivu. Stanice se samo koriste za uzgoj i one same ne završavaju u cjepivu osim u tragovima. Metodama filtracije i centrifugiranja uklanja se potencijalno prisustvo stanica ili njihovih dijelova. Eventualno zaostali proteini ili DNK/RNK stanica ne predstavljaju rizik i o tome smo već pisali. Najbolja je usporedba s mrkvom, mrkvu uzgajamo u zemlji, ali zemlja neće biti dio juhe (osim u tragovima).
 
Sve stanične linije na kojima se uzgajaju virusi za cjepiva prolaze kontrolu kvalitete o čemu smo već učili u kontekstu sterilnosti cjepiva. Kao što ste i vidjeli, relativno vrlo malen broj stanica koristimo za proizvodnju cjepiva jer su ove linije dobro ispitane (karakterizirane).
 
Podsjetite se kako stanice drugih organizama koristimo kod tzv. cjepiva dobivenih rekombinantnom DNK tehnologijom.
 
Slika: WI-38 stanice.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5/5
Podijelite dalje

dr. sc. Stribor Marković, mag. pharm.

1992. godine upisujem studije medicinske biokemije na Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu. Nakon završene četiri godine studija odlučujem upisati i studij farmacije. Svoj tadašnji znanstveni interes imao sam prilike razviti radeći kroz dvije godine diplomski rad kod dr. Blaženke Grahovac i cijelom tadašnjem timu Hrvatskog zavoda za transfuzijsku medicinu u čijem sam laboratoriju imao prilike napraviti svoje prve korake. Diplomirao sam na temu molekularnog određivanja vrste Borrelia burgdorferi sensu lato u kliničkim uzorcima. Zahvalan sam i drugoj mentorici, profesorici Marici Medić-Šarić na gotovo majčinskoj podršci i na prvoj znanstvenoj publikaciji. 1998. godine diplomirao sam oba studija i stekao titule magistra farmacije i diplomiranog inženjera medicinske biokemije. Vrlo kratko sam 1998. godine radio kao asistent na zavodu za organsku kemiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta, a već iste godine zapošljavam se u istraživačkom institutu PLIVA d.d. čiji sam stipendist bio dvije godine. Počeo sam raditi kao istraživač u grupi koja se bavila istraživanjem novih protuupalnih lijekova kod dr. Mladena Merćepa. Njemu sam zahvalan, kao i svim kolegama, na svemu što sam naučio u znanosti, a toga je bilo puno. Biram li između istraživanja u industriji i akademskom okružju odabirem industrijsko okružje. Plod toga je nekoliko znanstvenih publikacija i više patenata. Postajem direktor istraživačkog programa u PLIVA d.d., a potom i voditelj stanične biologije u GlaxoSmithKline (GSK). Teško je nabrojati sve što sam prošao u znanstvenom iskustvu, od in vivo modela, molekularne i stanične biologije i niza tehnika. Smatram to privilegijom jer današnji koncept znanosti u industriji katkad više ograniči ljude nego im daje slobode. Više se ne smatram istraživačem i znanstvenikom, premda je, tko zna, jednom moguće da se vratim na taj posao. Ne volim ni da me tako zovu jer se ne volim krivo predstavljati. Kao prilog svoje povijesti prilažem listu radova. Ipak, ta povijest posla mi je dala puno vrijednog i zahvalan sam nekima omraženoj farmaceutskoj industriji na svemu što znam. 2005. godine postao sam doktor farmaceutskih znanosti s temom disertacije „Konjugati makrolida i glukokortikoida kao nova klasa protuupalnih lijekova.“ 2011. godine igrom neobičnog slučaja zaposlit ću se u Imunološkom zavodu d.d. najprije na Zavodu za transfuzijsku medicinu, a potom i kao direktor kvalitete. Bez obzira na težinu, to mi je bila velika privilegija i naučiti suptilnosti kontrole kvalitete cjepiva i proizvoda ljudske plazme obogati čovjeka za nivo striktnosti u kvaliteti koju druge grane industrije jedva dosežu. Bila mi je teška odluka otići i dan danas mi je žao te institucije i predivnih kolega koje sam tamo upoznao. Gdje su tu eterična ulja i biljke? Bezazleni tečaj aromamasaže u Aromari 2001. godine na kraju se pretvorio u hobi i interes. Zahvalan sam svojoj tadašnjoj tvrtki da je to bez problema ne samo tolerirala već su me i neki kolege ohrabrivali. Stekao sam samo jednu impresiju: svijet ljekovitih biljaka i eteričnih ulja je kaotični divlji Zapad u odnosu na striktnost svijeta farmaceutske industrije. U njemu ima potencijala koji treba razviti. Vremenom, to mi je postao moj glavni posao. Trebao sam položiti test i vlastite naivnosti i vremenom sam izgradio sve jasniji stav što je u tom svijetu prirodnih tvari i lijekova smisleno, a što je odnijela povijest. Svijet New Age-a ostavio je gorke uspomene na svijet „alternative“ i o tome trebam jednom napisati knjigu. Moj interes prema biljkama proširio se davno u svijet kozmetike, ali osobno ružno iskustvo dr. Stribor kozmetike udaljilo me još prije 3 godine od tog svijeta. Što sam znao, prenio sam na Plantageu kao mali hommage tom vremenu. Ako ikada nadrastem to gorko iskustvo ovaj interes, barem u smislu hobija, možda će se vratiti. Da bi se to desilo, ono staro prvo mora umrijeti, ali o tome više ne odlučujem ja. Moj današnji svijet je uvijek podređen osobnom učenju i iskustvu. Savjetujem pacijente i drago mi je što sam uopće prvi u struci razvio takav koncept koji je dio posla XXI. Stoljeća. Zahvaljujem se Atlantic Farmacia na uspješnoj suradnji kroz godine. Educiram puno druge i iz povijesti svojih prethodnih poslova pokušavam prenijeti svoja iskustva drugima i poraditi na općem znanju ne samo medicinskih djelatnika već cijelog društva. Aktivno pišem na Facebooku, izdao sam knjigu koja je plod tog pisanja, u grupi Samoniklog jestivog bilja, ali i u grupi Cijepljenje/vakcinacija – grupa za sve koji imaju pitanja i nedoumice, čime se zahvaljujem Imunološkom zavodu. Znam biti težak, premda sam uglavnom blagog karaktera. Tvrdoglav sam, ponekad prednost, katkad mana. Tko me povrijedio/la i financijski iskoristio/la, zauvijek ima zatvorena vrata. Nisam zlopamtilo osim u ekstremima kojih, srećom, nema puno. Na prste dvije ruke. Volim planinariti, to već mnogi znaju. Volim biljke ali i sve prirodne znanosti. Govorim francuski i engleski jezik. Više na: https://www.plantagea.hr/o-meni/